腫瘤組織病理圖像定量分析在腹膜假黏液瘤中的研究進展

馬茹，閆風彩，李鑫寶，林育林，李雁，

(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院 a.腹膜腫瘤外科，b.病理科，北京 100038)

腹膜假黏液瘤(pseudomyxoma peritonei,PMP)是一種以黏液性腫瘤細胞產生的黏液在腹腔內積聚、再分布為特征的惡性臨床綜合征，典型臨床表現為黏液性腹水、腹膜種植、網膜餅和卵巢受累。PMP主要源自闌尾黏液性腫瘤，其機制為腫瘤阻塞闌尾腔、黏液持續聚集導致闌尾破裂穿孔，含有瘤細胞的黏液釋放入腹腔，沿兩側結腸旁溝再播散至全腹腔；也有少部分是來源于卵巢、胃、結腸等腹腔內器官的原發性黏液性腫瘤[1]。PMP的整體發病率為(2～4)/100萬，男女比例為1∶1.2～3.4，年齡為43～63歲，腫瘤細胞減滅術+腹腔熱灌注化療是目前的標準治療方案，可顯著延長患者生存期[2-3]。作為一種罕見的臨床腫瘤綜合征，PMP早期診斷困難，且認識參差不齊，極易引起漏診、誤診，進而延誤最佳治療時機。提高PMP診斷的準確性有助于更好地評估疾病進展及預后情況，從而為患者提供更合理的治療方案。

PMP的病理組織學分型和分級對疾病評估至關重要。目前國際公認的PMP組織病理學分類主要依據腫瘤細胞的數量及癌巢形態、細胞異型性、核分裂象及侵犯周圍形式等方面[4]，目前處于基于經驗的定性階段，腫瘤病理診斷的準確性高度依賴于病理特征、病理醫師經驗水平以及視覺搜索過程的交互作用，易受閱片者主觀情緒和疲勞閱片等因素影響。隨著數字病理的興起，腫瘤病理學逐漸由人工定性診斷向計算機輔助的定量診斷發展，極大地降低了醫師閱片負擔及誤診率，目前已應用于乳腺癌、結直腸癌等腫瘤的診斷[5]。建立客觀準確的病理圖像定量分析系統能有效提高病理學診斷預測PMP預后的價值。現就腫瘤組織病理圖像定量分析在PMP中的研究進展進行綜述。

1 腫瘤組織病理圖像定量分析

1.1病理圖像定量分析的發展歷程 1959年，Ledley和Lusted[6]首次將數學模型引入醫學，并于1966年提出計算機輔助診斷(computer-aided diagnosis,CAD)[7]，形成計量醫學，但隨后的十余年因技術瓶頸，CAD陷入低谷。19世紀80年代起計算機迅速發展，CAD才開始被認真且系統研究，并于1998年正式用于臨床[8-9]。同時期各種淺層機器學習模型被相繼提出，但由于理論分析及訓練方法經驗不足，多層神經網絡研究相對稀少。2006年Hinton和Salakhutdinov[10]提出深度網絡和深度學習的概念，開啟了深度學習的研究熱潮。20世紀90年代起，數字病理學成像技術見證了全切片掃描圖像技術(whole slide imaging,WSI)的誕生和發展，實現全切片掃描及全景信息獲取、全維度病理信息挖掘等，推動了CAD的圖像分析在組織病理領域的應用[11](圖1)。

1.2CAD的工作流程 數字病理學中的CAD開辟了圖像計算的新領域，將傳統手工特征與深度學習方法結合，可準確、定量地描述組織細胞形態結構變化以及肉眼不可見的亞視覺特征，以期揭示病理現象與疾病本質的關系，提高病理分型、診斷及預后評估的準確性。CAD的工作流程：①經圖像采集將顯微鏡下組織切片的圖像通過數碼相機或WSI轉化為能被計算機直接處理的數字圖像；②模擬病理醫師長期閱片等經驗學習過程處理并分析圖像，包括圖像預處理、圖像分割、目標參數選擇及測量；③根據臨床病理數據選擇有臨床意義的特征，并整合構建不同預后模型(圖2)。

HE：蘇木精-伊紅染色；CAD：計算機輔助診斷；WSI：全切片掃描圖像技術；DICOM：醫學數字成像和通信；FDA：食品藥品管理局圖1 病理圖像定量分析的發展歷程

1.2.1圖像采集 圖像采集是病理圖像分析的前提。傳統采集系統是通過安裝在顯微鏡上的數碼相機捕捉感興趣視野。近年來興起的WSI可掃描整張病理切片，實現高質量圖像的永久存檔、瀏覽及注釋，且不受時空限制[12]，因此可最大化地從中提取病理信息，做出客觀有效的決策。研究表明，使用WSI和常規顯微鏡進行病變診斷的準確度和精密度相似[13]。WSI不僅可用于一般組織細胞病理學及免疫組織化學診斷，還在遠程病理會診、教育及科學研究等方面有重要意義[14]。

1.2.2圖像預處理 圖像質量變化對后續的圖像分割和目的參數提取均有重要影響，處理不當可導致病理圖像定量分析準確性下降。這些變化由多種因素造成，包括疾病異質性或切片制備、圖像采集過程條件不一致等，如染色試劑的批次或制造商不同、組織切片厚度不等、染色方案不同及掃描條件差異等。適當的預處理可在一定程度上減少誤差，如祛除大的雜質斑點、敲除卷折或破損切片、圖像去噪、顏色歸一化處理消除染色不均、偽彩處理、增強圖像對比度等[15-16]。

1.2.3圖像分割 圖像分割的質量是決定測量精度的關鍵因素之一。圖像分割是基于區域或邊界的分割方法，或兩者結合，實現對組織病理圖像中感興趣區域的分割和提取，如對腫瘤組織病理圖像的細胞分割(如細胞核分割)、組織分割(腺體分割)等。

1.2.3.1分割算法 基于相鄰像素的特性可將分割算法分成基于邊界的算法(利用區域間特性的不連續性)和基于區域的算法(利用區域內特性的相似性)，較為常見的分割算法有閾值分割法、模糊聚類法、區域生長和深度學習等分割算法[17]。

閾值分割法以圖像像素的某一閾值(如灰度值)為分界值，劃分目標區域和背景區域，適用于像素對比度較大的圖像[18]；聚類分割法基于圖像像素的不同特征，按一定規則進行區域劃分，適用于形狀模糊的圖像，常與其他分割方法聯合使用[19]；區域生長法是將具有相似特征的圖像像素或子區域聚合形成區域塊實現圖像分割；深度學習是一種特殊的人工神經網絡，利用多層神經網絡完成足夠數量的數據訓練，進而識別圖像表征，實現圖像分割。與其他分割算法不同，人工神經網絡主要利用區域結構信息，而不依賴于染色強度或手工特征，因此具有較強的魯棒性[20]，越來越多地應用于醫學圖像處理。

a1-a2：腫瘤組織制備成病理切片；b1-b2：病理圖像采集；c1：PMP病理圖像中腺體分割；c2：PMP病理圖像中腫瘤癌巢與間質分割；c3：乳腺癌病理圖像中腫瘤細胞核分割，CAD：計算機輔助診斷圖2 CAD的工作流程

1.2.3.2圖像分割應用 腺體分割——腺體形狀對腺癌的診斷具有重要意義。腺體結構形狀與腫瘤分級有很強的相關性，可用于識別正常組織與不同惡性程度的腫瘤。Nguyen等[21]根據腺體形狀和大小制訂了一種與腫瘤惡性程度相關的癌癥指數，用于區分正常組織與前列腺癌組織。Sirinukunwattana等[22]提出了一種新的組織學圖像腺結構隨機模型，這種隨機多邊形模型可用于檢測和提取正常結腸組織圖像中的腺狀結構。Cruz-Roa等[23]提出的卷積神經網絡(convolutional neural networks,CNN)可用于乳腺癌WSI中浸潤性導管癌的分類，其結果優于基于手工特征的圖像分割。

癌巢分割——腫瘤微環境通過腫瘤細胞與基質成分協同作用影響腫瘤細胞的增生、侵襲及轉移。腫瘤細胞和腫瘤微環境特征在腫瘤病理圖像定量分析中有重要作用。闞賢響等[24]基于像素級別分類方法引入間隔采樣和閾值法，該分割模型實現蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色)的乳腺癌組織病理圖像中癌巢與間質的分割。Linder等[25]采用一種基于紋理的局部二值模式算法，從組織芯片圖像中成功分割上皮和間質成分。Beck等[26]開發的計算機輔助機器學習系統能實現腫瘤實質與間質組織區域的分割，通過測定乳腺癌腫瘤上皮和基質中的圖像特征發現，腫瘤基質形態結構是乳腺癌的獨立預后因素。Xu等[27]利用CNN的特征學習方法，實現乳腺癌和結直腸癌病理圖像中上皮與間質細胞的自動分割。

細胞核分割——腫瘤細胞核的定位是定量研究腫瘤病理學的一個重要方向，分析細胞核的大小、形狀、輪廓及有絲分裂象等形態特征對腫瘤的早期檢測和預防有重要作用。Fatakdawala等[28]依據良惡性細胞核形態及間質染色特點，應用活動輪廓模型從HE染色的組織病理圖像中分割出單個細胞核。Abdolhoseini等[29]提出了一種基于多級閾值分割技術和分水嶺算法聯合的細胞核分割方法，適用于不同染色方法獲得的組織病理圖像。Song等[30]基于多尺度CNN和圖像分割法精確分割細胞質和細胞核，將細胞核從圖像中提取出來。局部敏感的CNN可自動檢測和分類HE染色的癌組織細胞核，在結直腸癌圖像數據集評估中顯示該算法效果良好[31]。有絲分裂象是細胞核的特殊形式，檢測有絲分裂有助于評估腫瘤的增殖活性。Wang等[32]將手工特征(形態、顏色、紋理特征)與CNN相結合檢測有絲分裂象，與單純深度學習或基于手工特征的算法相比，這種集成方法的檢測精度更高。

其他應用——圖像分割還可用于腫瘤生物學標志物的定量分析：Niazi等[33]提出了一種深度學習方法，可用來區分Ki-67染色的腫瘤和非腫瘤區域，有望解決免疫組織化學染色中的假陽性問題。

1.2.4目標參數選擇及測量 圖像分割后，需要先去除錯誤檢測區域、填充微小孔洞等后才能用于測量[34]。病理學家通常采用低、中、高分辨率讀取病理圖像中不同的形態結構特征，最大程度地描述組織形態，包括像素級、對象級以及語義級三個層次的特征。像素級特征描述圖像的顏色和紋理特征，顏色特征量化顏色擴散、突出和共現，紋理特征量化圖像的清晰度、對比度、強度變化等。對象級特征描述細胞結構的屬性，如細胞核、細胞質和腺體等的形狀、紋理和空間分布[35]。語義級特征是基于低層次特征獲得的描述細胞間生物學領域的信息，如一定區域內的對象密度、不同對象數量比和空間結構等[36]。

圖像測量涉及大量參數，主要包括三類：①幾何參數，描述組織、細胞結構的形狀及大小，如周長、面積、圓形度、密度參數、分布參數等；②光密度參數，描述圖像信號強弱變化以反映細胞中某物質的顯色強度，如平均光密度、積分光密度等；③特化參數，描述某一結構量化特征的專用參數，如細胞增生指數、核質比等[17,36]。

1.2.5定量特征建模 上述病理圖像中提取的特征參數不僅可以準確、定量描述腫瘤組織和細胞的形態結構變化，提高傳統病理診斷的客觀性和工作效率，而且可從病理圖像的大量特征中挖掘潛在信息，發現新的診斷指標。將這些人眼不易識別或總結的指標，通過計算機技術分析與腫瘤病情發展、預后之間的關系，一定程度上可作為診斷和判斷預后的依據。Chen等[37]采用CAD圖像分析乳腺浸潤性導管癌患者的HE染色圖像，提取出730個形態學參數，Kaplan-Meier生存分析顯示12個參數與無病生存期顯著相關，Cox比例風險回歸模型顯示癌巢特征、癌巢細胞核特征、間質細胞結構特征以及癌巢細胞密度是影響預后的獨立因素，并以此建立了乳腺浸潤性導管癌預后模型。Bychkov等[38]利用卷積和遞歸架構訓練出的深度網絡分析腫瘤組織病理圖像以預測結直腸癌的預后。結果顯示，與有經驗的病理醫師相比，深度學習可以從結直腸癌的病理組織形態中提取更多的預后信息。CAD可從腫瘤組織病理圖像中挖掘可能影響預后的信息，幫助預測疾病的發展和預后情況，從而使腫瘤患者獲得更為精準的治療。

2 PMP病理圖像分析的發展

2.1PMP病理的發展歷程 1995年，Ronnett等[39]將黏液腫瘤分為：①播散性腹膜黏液腺瘤病(disseminated peritoneal adenomucinosis,DPAM)，腫瘤上皮細胞較少有細胞異型性或核分裂象；②腹膜黏液腺癌病(peritoneal mucinous carcinomatosis,PMCA)，腫瘤上皮細胞表現為癌的組織學和細胞學特征；③PMCA-I，具有中間型組織學特征。2005年，Loungnarath等[40]在Ronnett等[39]的基礎上加入腫瘤形態和是否存在印戒細胞兩個特征將PMP分為：①DPAM(G1)，腫瘤上皮細胞呈單細胞或單層排列包繞腺體結構，纖維基質成分少，上皮細胞無異型性或有絲分裂象；②混合型(G2)，大部分腫瘤特征與DPAM類似，但出現明顯的細胞異型性和腺體結構融合；③黏液腺癌(G3)，明顯細胞異型性、侵襲性，或出現印戒細胞。Bradley等[41]研究發現，DPAM和PMCA-I患者的器官侵犯發生率及生存率比較差異無統計學意義，但PMCA的預后差，基于此研究結果將PMP分為低級別和高級別兩類。2016年，腹膜表面腫瘤國際聯盟就PMP病理類型達成共識，根據腫瘤細胞數量及癌巢形態、細胞異型性、核分裂數及侵犯周圍形式分為無細胞性黏液、DPAM、PMCA、PMCA伴印戒細胞(PMCA-S)四類[4](圖3、4)。

2.2PMP病理圖像定量分析現狀 PMP的組織學分級是影響患者預后的獨立因素，對患者治療方案的選擇和療效評估尤為重要。目前國際公認的PMP病理組織學分級主要根據腫瘤細胞數量及癌巢形態、細胞異型性、核分裂數及侵犯周圍形式等對腫瘤進行評估，結果的準確性受病理醫師經驗水平、病理圖像特征復雜程度等因素影響；此外，Mohamed等[42]研究發現，盡管大量病理學類型為DPAM的PMP患者預后相對較好，但部分DPAM患者死于快速進展的侵襲性疾病，5年生存率低于分化類型更差的DPAM-I患者，這與既往研究矛盾[39]。該研究認為，目前的病理學分類尚不足以準確預測患者預后，需要更深入的病理圖像特征分析輔助。國內外已有少數學者嘗試對PMP的病理圖像進行定量分析，但由于PMP較為罕見且研究起步較晚，病理圖像相關研究還處于半定量階段，且研究較為粗糙，計算方法簡單。

PMP：腹膜假黏液瘤；DPAM：播散性腹膜黏液腺瘤病；PMCA：腹膜黏液腺癌病；HE：蘇木精-伊紅；3a：無細胞性黏液：纖維結締組織中可見大量黏液，黏液中無上皮細胞；3b：DPAM：黏液內上皮成分罕見，腫瘤細胞呈條帶狀、簇狀或島狀結構，腫瘤細胞輕度異型性，核小且規則，核分裂象罕見；3c：PMCA：腫瘤上皮細胞多，可排列呈條索狀、篩狀或島狀等；腫瘤細胞高度異型性，核大且核仁明顯，核分裂象常見；3d：PMCA-S：黏液中漂浮大量印戒細胞，胞質中大量黏液聚集，核位于細胞一側，藍色箭頭所示為印戒細胞圖3 PMP主要病理學類型(HE染色×200)

PMP：腹膜假黏液瘤；DPAM：播散性腹膜黏液腺瘤病；PMCA：腹膜黏液腺癌病；PMCA-I：中間型；PMCA-S：腹膜黏液腺癌病伴印戒細胞；PSOGI:腹膜表面腫瘤國際聯盟圖4 PMP病理診斷學研究的發展歷程

Badyal等[43]回顧性分析21例PMP患者的腹水涂片，觀察細胞密度(低、中、高)、黏液物質特征、上皮細胞簇數量、細胞異型性(輕、中、重)、核仁、核分裂象和印戒細胞等的情況。上皮細胞簇數量用半定量法評估：在高倍鏡視野(×400)下，0(無細胞簇)、+(少量，1～3個細胞簇)、++(中量，3～10個細胞簇)、+++(大量，>10個細胞簇)。結果顯示，PMCA具有高細胞密度、中度至重度細胞異型性、大量上皮細胞簇和明顯的核仁及有絲分裂象。該研究除了上皮細胞簇的計數使用較為客觀的分層方法，其余觀察指標如細胞密度、核仁情況、細胞異型性和有絲分裂象等仍依賴病理醫師主觀視覺搜索的傳統閱片模式，未進行定量評估。

Bhatt等[44]根據腫瘤組織的細胞學特征將DPAM分成三個亞組，組1為單層柱狀上皮，組2為低級別柱狀上皮細胞，組3為局灶高級別柱狀上皮細胞。隨訪顯示：組1患者均存活，且組1和組2患者的無病生存期長于組3。但由于患者數量較少，無法得出統計學差異，需要行進一步的大樣本數據研究。雖然該結果未獲得驗證，但為PMP預后評估研究提供了新思路，即腫瘤細胞形態可能對PMP的預后有重要影響。

Choudry等[45]回顧性分析了310例行腫瘤細胞減滅術聯合腹腔熱灌注化療術治療的PMP患者的臨床病理資料，根據腫瘤上皮細胞密度將患者分為4組：無細胞性黏液、低細胞密度(<2%)、中細胞密度(2%～19%)、高細胞密度(>20%)。結果顯示：與無細胞性黏液患者相比，中或高細胞密度的PMP患者的無進展生存期更短。Horvath等[46]的研究也得到類似的結果，其參照Choudry等[45]的研究，回顧性分析25例DPAM患者的臨床病理資料發現，隨著細胞密度的升高，PMP患者的復發風險也隨之增加。以上兩項研究提示，中或高細胞密度的PMP患者具有更強的腫瘤生物學活性，疾病進展風險也更高。以上發現有助于指導患者的預后隨訪，對中或高細胞密度的PMP患者需進行深入而細致的隨訪以早期發現復發性疾病。

腫瘤細胞密度、形態等病理學特征可能會影響PMP患者的預后，其不僅為PMP預后預測提供新的研究方向和研究指標，也是對現有PMP的組織學分級診斷體系的補充。

3 結 語

當前研究提示，PMP的病理圖像定量分析可以用于挖掘影響患者預后的信息，但PMP作為一種罕見病，病理研究起步較晚；且由于病理圖像本身的復雜性，少有類似于免疫組織化學或熒光染色的商業化圖像分析軟件，這些因素導致PMP的病理圖像分析發展緩慢，目前針對PMP病理圖像的研究多為經驗性分析診斷。數字病理圖像定量分析在其他腫瘤中已進行廣泛深入的研究，PMP亟須建立計算機輔助的圖像定量分析，以提高PMP組織學分級的精確性。