表觀遺傳修飾參與神經病理性疼痛的相關機制

李依澤，于泳浩

(天津醫科大學總醫院麻醉科 天津市麻醉學研究所，天津 300052)

中樞或外周神經系統炎癥、損傷或疾病可以引起神經病理性疼痛(neuropathic pain，NP)，其全球患病率為6%～8%[1]。NP可發展為慢性疼痛，表現為異常性疼痛、痛覺過敏和自發痛，患者可出現失眠、抑郁等精神癥狀，嚴重影響患者的生活質量，增加了醫療費用，導致生產力降低。臨床鎮痛藥物(如阿片類藥物、非甾體抗炎藥)治療NP的效果個體差異較大，可能產生多種藥物不良反應。NP的發病機制尚不明確，尚無有效防治策略。周圍炎癥和神經損傷在背根神經節(drosal root ganglion，DRG)、脊髓和大腦其他與疼痛相關區域的初級感覺神經元中有多種受體、離子通道、神經遞質、酶、神經調節劑和結構蛋白，并可在轉錄和翻譯時發生變化[2-4]。上述變化有助于誘發和維持NP，但如何通過周圍有害刺激調節相關機制仍未明確。研究表明，NP相關基因調節涉及表觀遺傳修飾機制，包括慢性疼痛情況下DNA甲基化修飾、組蛋白修飾和微RNA(microRNA，miRNA)的變化[5]，可能是中樞神經元在受到炎癥/神經損傷后誘發疼痛相關基因改變的原因。現就表觀遺傳修飾參與NP的機制予以綜述，以期為NP的治療提供新的思路和藥物靶點。

1 DNA甲基化修飾

1.1甲基-CpG結合蛋白2 (methyl-CpG-binding protein 2，MeCP2) MeCP2是一種對甲基化細胞素有親和力的蛋白，對神經元的發育和功能起著重要作用，可調控神經元的大小和形態、突觸遞質釋放及突觸可塑性；還可與組蛋白脫乙酰酶 (histone decacetylases，HDACs)組成轉錄抑制因子復合物，與多次神經損傷后的NP相關[6]。MeCP2基因突變引起Rett綜合征，以痛覺受損為臨床表現。周圍神經損傷后小鼠背根神經節MeCP2表達的增加。MeCP2與DNA結合后可引起DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)對DNA的CpG甲基化增加，抑制其下游靶基因轉錄。神經損傷后與miR-126位點結合的富集MeCP2抑制miR-126的表達，miR-126的下調導致神經2a細胞和脊神經損傷模型中Dnmt1和Vegfa兩個靶基因上調；此外，在不同疼痛狀態下，DNMT、HDACs和MeCP2表達增加，與MeCP2靶基因的變化相平行。NP時，MeCP2的再分配可導致DRG基因表達的直接和間接調節作用[6-7]。因此，MeCP2是表觀遺傳調控誘導的神經損傷分子變化的重要分子。

1.2DNMTs DNMTs是哺乳動物DNA甲基化的關鍵調節酶。DNMT3a可減少mu-阿片受體(mu-opioid receptor，MOR)和疼痛相關離子通道的表達。神經損傷可誘導背根神經節DNMT3a表達的增加，并抑制MOR表達，阻斷DNMT3a表達可使MOR表達恢復，并恢復嗎啡鎮痛作用。DNMT3a對MOR基因甲基化的調控需要甲基-CpG結合蛋白1參與，敲除甲基-CpG結合蛋白1可導致DNMT3a與MOR基因啟動子的結合降低，從而阻斷DNMT3a觸發背根神經節對MOR基因表達的抑制[8]。此外，脊神經結扎(spinal nerve ligation，SNL)模型腰段背根神經節中DNMT3a的表達增加可引起電壓依賴性鉀通道亞基Kcna2的表達減少。在無神經損傷的情況下，過表達DNMT3a可增加Kcna2啟動子區域甲基化，降低Kcna2啟動子活性，減少Kcna2表達，降低鉀電流，增加DRG神經元興奮性，并導致脊髓中樞敏化和NP癥狀[9]，表明DNMT3a可能通過抑制DRG中MOR和Kcna2的表達而導致NP。

DNMT抑制劑5-AZA可通過上調慢性壓迫性損傷(chronic compress injury，CCI)大鼠腰椎脊髓中某些DNA甲基化依賴性抗傷害性基因的表達來減輕NP[10]。另外，SNL模型腰段脊髓DNMT3b表達下調可導致CXC趨化因子受體(chemokine C-X-C motif receptor，CXCR)3基因的去甲基化，并增加脊髓神經元中CXCR3的表達，上調的CXCR3可通過促進中樞敏感作用導致NP[11]。由此可見，MeCP2和DNMTs在NP的發展中起到重要作用，但MeCP2和DNMTs與傷害感受相關的特定基因的調控關系仍然需要更深入的探討和驗證。

2 組蛋白甲基化修飾

2.1Zeste基因增強子2(enhancer of zeste 2，EZH2) EZH2是多梳抑制復合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)的亞基，催化組蛋白H3在賴氨酸27的二甲基化和三甲基化(H3K27Me2/3)，導致相關基因沉默。PRC2復合物的增加可能有助于保護神經元免于神經變性[12]。在正常條件下，EZH2由脊髓背角神經元表達。有研究顯示，甲基轉移酶EZH2參與了NP的形成和維持，NP損傷可引起大鼠腰段脊髓背角的EZH2表達增加，表達EZH2的小膠質細胞數量可突增7倍以上[13]。抑制EZH2減弱了炎癥介質的表達以及NP大鼠的機械和熱痛覺過敏的發展和維持。使用EZH2抑制劑EPZ-6438可劑量依賴性地抑制體外小膠質細胞脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的炎癥基因表達[14]。因此，EZH2可能是免疫調節治療NP的有效靶點。

2.2G9a G9a是一種H3K9甲基轉移酶，又稱EHMT2常染色質組蛋白賴氨酸N-甲基化轉移酶(euchromatic histone-lysine N-methyltransferase，EHMT2)，負責定位組蛋白甲基化位點，多項研究證實，EHMT2有助于促進NP初級感覺神經元中多種基因轉錄的抑制。神經損傷可引起G9a表達增高，繼而升高H3K9me2水平，并在鉀通道啟動子部位富集，抑制相關基因轉錄，可引起多種鉀離子通道的沉默，并促進周圍神經病變后NP的發展[15]。阿片類藥物是疼痛藥物治療的金標準，但阿片類藥物治療NP的效果欠佳，與神經損傷引起DRG和脊髓神經元中MOR的下調，導致阿片類藥物作用靶點減少有關。研究發現，神經損傷可引起G9a高表達，G9a通過提高MOR啟動子中的H3K9me2水平，使DRG中MOR表達降低，從而減弱阿片類藥物的鎮痛作用[16-17]。敲低G9a可逆轉編碼MOR的Orpm1基因表達的下調，并恢復嗎啡的鎮痛作用，減輕嗎啡耐受。對NP大鼠模型的研究顯示，DNA甲基化抑制劑5-aza-dC可通過減少MOR基因的甲基化來增加DRG中MOR的表達，從而增強嗎啡的鎮痛作用[16]。由此可見，G9a可易化NP的發生，并與增加H3K9me2水平抑制多種疼痛相關鉀通道、MOR表達相關。

2.3神經元限制性沉默因子(neuron-restrictive silencer factor，NRSF) NRSF阻遏復合物包括NRSF、CoREST、LSD1、BHC80和BRAF35。NRSF阻遏復合物還招募了額外的沉默分子，如HDAC1/2、MeCP2和G9a，以鞏固抑制作用。NRSF阻遏復合物通過去除活性組蛋白標記來抑制基因表達，如H3K4甲基化或各種組蛋白乙?；痆18]。小鼠CCI模型研究顯示，DRG中NRSF信使RNA和蛋白質增加，并在神經損傷后數周內維持較高水平。NRSF的靶基因表達水平如Kcnd3、Kcnq2和Scn10a(分別編碼通道Kv4.3，Kv7.2和Nav1.8)，以及Oprm1和Gad2受到抑制，從而促進了外周感覺纖維的神經興奮性而產生NP[19-20]。因此，NRSF表達增加參與NP的產生和維持。

2.4含Jumonji結構域蛋白3(Jumonji domain-containing protein 3，JMJD3) JMJD3 是組蛋白去甲基化酶，可特異性去甲基化H3K27me2/3，產生去抑制作用。脊髓損傷導致內皮細胞中JMJD3增加，JMJD3可增加細胞因子白細胞介素-6啟動子去甲基化，增加白細胞介素-6的表達，從而參與炎癥相關的NP[21]。JMJD3還可以通過增加神經損傷后DRG神經元中腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達參與NP。體外研究顯示，N-甲基-D-天冬氨酸刺激神經元后，可將JMJD3募集到BDNF啟動子，導致BDNF啟動子去甲基化增加，有助于增加神經元中的BDNF的表達[22]?？梢姡珺DNF啟動子的表觀遺傳修飾在體外神經元活化中具有至關重要的作用。體外神經元損傷后，JMJD3可能通過減少炎癥因子和神經營養因子的表達治療NP。

3 組蛋白乙?；揎?/h2>

3.1組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase，HATs) 神經損傷誘導受損神經的巨噬細胞和中性粒細胞中趨化因子及其受體的表達增加可導致NP，上述蛋白質的表達增加通常伴隨著啟動子H3K9的乙?；?H3K9Ac)的增加[23]。有研究表明，漆樹酸(HATs抑制劑)能抑制C-C趨化因子配體(chemokine C-C motif ligand，CCL)2、CCL3、CXCR2表達增加，表明上述趨化因子可隨H3K9乙酰化水平的升高而上調，進而參與神經損傷引起的NP。此外，研究顯示，脊髓H3K9Ac水平對CXCR2和CCL1的表達增加起到重要作用，阻斷CXCR2可逆轉機械痛的痛閾降低。而辛二酰苯胺異羥肟酸(HDAC抑制劑)可顯著加劇切口痛的機械痛[24]。姜黃素(HAT活性抑制劑)可減少BDNF和環加氧酶-2的表達，從而降低CCI大鼠的NP[25]。由此可見，抑制HAT活性可減輕炎癥和NP。

3.2HDACs HDACs抑制劑可作為嗎啡治療NP的輔助鎮痛藥物。通常情況下，組蛋白去乙?；瘯o密濃縮染色質，導致基因沉默。研究表明，抑制HDACs可緩解炎癥性疼痛，并減弱NP模型中痛覺過敏的發展[26-27]。HDACs抑制劑可抑制細胞因子表達，減輕與炎癥相關的NP[26]。小鼠神經損傷可引起背角小膠質細胞HDAC1增加和H3K9Ac水平降低，HDAC1特異性抑制劑(LG325)可使HDAC1表達呈劑量依賴性降低，并提高H3K9Ac水平，從而減輕NP誘發的痛覺過敏[27]。MOR、DOR和Nav1.8通道在NP痛覺信號傳遞中具有重要作用，其啟動子區乙?；降慕档涂上抡{信使RNA和蛋白的表達，參與NP的形成和維持[28]。HDACs抑制劑治療(如丙戊酸、曲古抑素A和伏立諾他治療)可通過提高乙?；秸{控疼痛相關基因表達，進而減輕NP并恢復嗎啡的鎮痛作用[29-30]。

3.3去乙?；?sirtuin，SIRT) SIRT1的天然化合物可減輕NP，并減少組蛋白H3乙酰化，減少微小膠質細胞活化，抑制炎癥[31]。因此，SIRT1和SIRT2可能成為治療NP的潛在藥物。CCI模型可引起L4/L5脊髓節段的SIRT1表達減少，在大鼠CCI相關研究中，SIRT2在DRG中下調，SIRT2的過表達可抑制核因子κB信號傳導并減輕機械異常性疼痛和熱痛覺過敏。使用SIRT2特異性抑制劑可導致NP疼痛程度明顯加重，減弱SIRT2過表達可緩解NP的作用[32]。

4 miRNA

無轉錄功能miRNA在基因表達活性依賴性調控中起到關鍵性基因調節功能。典型miRNA含有17～24個核苷酸，可結合信使RNA抑制蛋白質翻譯轉錄后調控機制[33]。miRNA調節中樞神經系統中疼痛相關基因的表達提示miRNA可作為慢性疼痛治療新途徑[34-35]。大鼠CCI模型DRG中，miR-19a和miR-221增加，直接導致細胞因子信號轉導抑制分子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)1水平降低，抑制miR-19a和miR-221可減少SOCS1消耗，降低炎癥引起的機械痛和熱痛[36]。此外，還可通過特異性抑制劑下調miR-218，減少SOCS3表達，繼而減輕NP[37]。CCI后，BDNF的表達水平受到DRG中miR-206和坐骨神經中miR-1的調節，神經損傷后，miR-206和miR-1減少，并誘導BDNF表達，產生機械和熱痛覺過敏。miR-206可直接作用于BDNF的3′非翻譯區，抑制BDNF表達，還可降低促炎細胞因子表達，延緩NP的發展[38]。研究顯示，脊髓小膠質細胞的miR-32-5p在SNL后增加，雙特異性磷酸酶5(Dusp5)作為該miRNA的直接靶點，參與NP和神經炎癥。miR-146a-5p通過抑制脊髓中腫瘤壞死因子受體相關因子-6及其下游信號分子Jun激酶/CCL2來減輕NP[39]。另有研究顯示，CCI大鼠脊髓中的miR-93亦減少，miR-93直接作用于炎癥調節因子轉錄因子3的轉導因子和激活因子，miR-93過表達可顯著抑制STAT3的表達，并且減輕CCI大鼠的炎癥和NP的發展[40]。miR-96抑制鈉電壓門控通道Nav1.3表達，神經損傷增加Nav1.3表達而鞘內注射miR-96抑制Nav1.3表達并減輕CCI后的NP[41]。同樣，miR-30b可控制神經損傷后的Nav1.7表達。miR-30b敲低卻可顯著增加正常大鼠的痛覺敏感性，而miR-30b過表達可抑制鈉電壓門控通道α亞基9的轉錄，從而緩解神經痛[42]。另外，miR-183簇控制著超過80%的NP調控基因，并且可以控制基礎機械敏感性和機械性痛覺，如控制電壓門控鈣通道亞基α2δ-1和α2δ-2以及酪氨酸激酶受體B+觸覺傳感器[43]。SNL大鼠同側脊髓背角可增加DNMT3a的表達，可引起miR-214-3p啟動子高甲基化相關表達的降低，DNMT3a介導的miR-214-3p表觀遺傳抑制增強了星形膠質細胞集落刺激因子-1的產生，從而誘導SNL模型大鼠的神經炎癥和疼痛行為[44]。表明某些miRNAs可能對NP具有治療效果，有望成為新型NP治療藥物。

5 小 結

表觀遺傳學與NP的產生和維持存在重要的相關性。其中包括DNA甲基化修飾、組蛋白甲基化修飾、組蛋白乙?；揎椧约癿iRNA等機制參與調控NP相關的受體、神經遞質、炎癥細胞因子、離子通道等。然而，目前表觀遺傳調控異常在NP形成和發展中的作用和治療相關機制尚不明確，還需要進行深入探討。對表觀遺傳學角度進行的新型NP治療藥物的研究，將為疼痛的機制提供新的理論基礎和新的用藥靶點。