LncRNA參與BMSCs成骨相關轉錄因子及信號通路的研究進展

何薇，許艷華

(昆明醫科大學附屬口腔醫院正畸科，昆明 650000)

間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一種多潛能干細胞，具有自我更新和多向分化的潛能，可分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌腱細胞、成核細胞和肌細胞等多種細胞類型[1]。MSC可以從多種類型的間充質組織中獲得，如骨髓、脂肪、臍帶、胎盤、肺、肝和皮膚等[2]。與長骨相比，來源于頜骨的骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有更強的成骨分化能力[3-4]。隨著對MSC生物學和分子遺傳學等其他領域了解不斷加深，發現MSC為骨科、自身免疫和缺血性疾病提供了新的治療選擇[5]。人類基因組工程的完成，證實了93%的人類基因組能夠轉錄成RNA，但只有2%能夠被翻譯成蛋白質，其余98%的RNA稱為非編碼RNA[6]。長度超過200個核苷酸的非編碼RNA被定義為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。盡管許多lncRNA被認為可能是轉錄噪聲或RNA加工時的副產物，但越來越多的證據表明它們中的很大一部分是功能性的，且參與調控各種類型細胞的生長和分化[7-9]。提高BMSCs成骨分化能力是抑制骨吸收、促進骨改建的關鍵。已有研究證實，蛋白編碼基因和小的非編碼RNA參與了BMSCs向成骨細胞的分化[10]。雖然功能性lncRNA參與了BMSCs的成骨分化，但大多數lncRNA的功能尚不清楚。BMSCs的表達和分化是否依賴于LncRNA目前也不清楚。現就lncRNA參與BMSCs成骨相關轉錄因子及信號通路的研究進展予以綜述。

1 lncRNA概述

近年來，在RNA測序技術的幫助下，已經確定了數以千計的短鏈和長鏈非編碼RNA，揭示了大多數基因組實際上是轉錄的，但只有1%～2%的轉錄本編碼蛋白質[8]。而lncRNA與信使RNA類似，通常由RNA聚合酶Ⅱ轉錄并且被剪接和多腺苷酸化，但其沒有或只有很低編碼潛能。lncRNA主要表現為細胞類型和發育階段特異性表達模式，在調節多種多樣的細胞功能方面發揮著重要作用。基于與附近蛋白質編碼基因相關的基因組位置，可以將lncRNA分為有義、反義、內含子、基因間和增強子lncRNA，同時lncRNA的功能也要復雜得多。lncRNA在不同的細胞類型中表現出特異性和多樣化的亞細胞定位，這取決于它們的分子功能。與微RNA(microRNA，miRNA)不同，lncRNA的功能并不局限于與其他RNA相互作用，lncRNA也可與蛋白質和DNA相互作用，在不同的細胞間隔中表現出非常不同的分子功能[11]。首先，lncRNA通過與蛋白質的相互作用，可以作為蛋白質復合物的支架，指導靶向蛋白質復合物(如染色質修飾物)到特定的位點[12]，然后通過信號分子調控細胞進程，根據蛋白的亞細胞定位將蛋白從染色質中隔離[13]。其次，核lncRNA也可直接或間接與基因組DNA相互作用，招募表觀遺傳修飾到一個特定的位點，而其他的lncRNA，如 XIST(long non-coding RNA X inactive specific transcript)和H19則結合鄰近的基因組位點，啟動基因組印跡[14]。最終，lncRNA通過控制細胞剪接、穩定性和翻譯，調節蛋白質編碼轉錄物直接與RNA相互作用而發揮功能[15]。

2 與lncRNA相關的轉錄因子及信號通路

BMSCs向成骨細胞分化涉及復雜的信號通路，且多種細胞因子參與其中。通過基因芯片技術可以分析基因組的序列信息以及基因組之間的差異表達。Wang等[16]采用基因芯片技術首次揭示了lncRNA在人BMSCs成骨分化中的表達譜，在BMSCs成骨分化過程中共鑒定出1 206個與成骨表達差異的lncRNA。同時，有研究者使用微陣列的轉錄組譜分析BMSCs成骨分化過程中有差異表達的編碼和非編碼基因，并通過進一步的生物信息學分析發現，BMSCs成骨分化可能與多種信號通路相關，且lncRNA參與其中[17]。

2.1骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)與lncRNA BMSCs成骨分化受多種細胞因子和生長因子的調控，BMP-2是眾所周知的BMSCs成骨分化的有效誘導因子[18-19]。而 HOX轉錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是最早發現的反式作用lncRNA，在胃癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、急性白血病等多種腫瘤組織和細胞中均存在HOTAIR的異常表達[20]。Wei等[21]研究了HOTAIR在非創傷性股骨頭壞死中的成骨分化和增殖作用，提取股骨頭壞死患者的股骨BMSCs，分析HOTAIR在BMP-2誘導的成骨分化過程中的表達情況，結果顯示，成骨細胞分化誘導因子BMP-2作用后，HOTAIR在BMSCs的表達顯著降低，提示HOTAIR可能是BMSCs分化過程中的重要因素；研究還顯示，HOTAIR下調導致BMP-2誘導的BMSCs中的 Ⅰ 型膠原α1鏈信使RNA表達增加，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性升高。這些數據證實HOTAIR是成骨分化的調節因子，也與股骨頭壞死疾病相關。Li等[22]也確定了一種lncRNA，即Bmncr，Bmncr在衰老過程中可以調節BMSCs的命運，Bmncr通過維持細胞外基質蛋白纖維調節素和激活BMP-2途徑來調節BMSCs的成骨，Bmncr通過細胞外基質蛋白纖維調節素介導的細胞黏附于骨表面，激活BMP-2通路，操縱BMSCs成骨穩態環境，影響細胞成骨過程。

與其他BMPs不同，BMP-1不屬于轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族，BMP-1可以誘導骨和軟骨發育。Zhang等[23]研究發現，miR-29b-3p在骨質疏松中高表達，通過熒光素酶活性可以測定BMP-1是miR-29b-3p的靶基因；進一步實驗發現，lncRNA核富集轉錄體1(nuclear enriched transcript 1，NEAT1)對BMP-1具有正調節作用，同時lncRNA NEAT1對miR-29b-3p具有負調節作用，NEAT1通過調節miR-29b-3p/BMP軸促進BMSCs的成骨分化。這項研究確定了BMP-1和NEAT1在骨質疏松癥中的潛在作用，有助于了解骨質疏松癥的發病機制，并找到治療骨質疏松癥的新靶點。經過進一步的研究，利用生物信息軟件分析發現，MSX1(muscle segment homeobox-1)、BMP-1和Smurf1這3個成骨基因周圍存在相關聯的lncRNA，其中2個lncRNA(AF289591和uc003xbe)與成骨基因BMP-1相關[24]。

BMP-4是BMP家族的另一個成員，對BMSCs生長調節、分化和存活起關鍵作用[25]。BMP-4是神經系統發育過程中重要的形成蛋白，研究發現，BMP-4也參與成骨，lncRNA母系表述基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)過表達可通過靶向調控BMP-4轉錄促進BMSCs成骨分化，位于BMP-4基因附近的MEG3可以使轉錄因子SOX2(SRY related HMG box-2)與BMP-4啟動子解離，從而影響細胞成骨，提示lncRNA MEG3的表達可以為治療多發性骨髓瘤提供新的證據[26]。

2.2Runx蛋白家族與lncRNA Runx2屬于Runx蛋白家族，是一種能誘導BMSCs向成骨細胞分化和成熟的關鍵轉錄因子，在骨修復與重建中發揮重要作用[27]。使用lncRNA芯片分析糖皮質激素處理的BMSCs中lncRNA TCONS_00041960的表達情況，發現TCONS_00041960的上調促進了成骨基因Runx2的表達[28]。Zhuang等[29]對來自健康供體和青少年特發性脊柱側凸(adolescent idiopathic scoliosis，AIS)患者的BMSCs進行微陣列分析，結果發現，一種新的lncAIS(基因符號：ENST00000453347)與AIS患者BMSCs成骨有關，AIS BMSCs中的lncAIS下調不能募集核因子蛋白90，且消除了同源異形盒D8(homeobox gene D8，HOXD8)信使RNA的穩定性，阻礙了Runx2轉錄，阻止了細胞成骨分化。Cui等[30]用不同濃度的葡萄球菌蛋白A對人BMSCs進行處理，模擬體外炎癥微環境，使用lncRNA微陣列分析在葡萄球菌蛋白A觸發的炎癥微環境中BMSCs成骨分化期間lncRNA和信使RNA的完整表達譜，結果發現，用NONHSAT009968慢病毒感染來沉默BMSCs中NONHSAT009968的表達，Runx2的活性增加，表明lncRNA NONHSAT009968可能是促進成骨細胞形成的新靶點。

2.3Wnt/β聯蛋白(β-catenin)信號通路與lncRNA lncRNA可以通過調節信號通路激活BMSCs調節成骨。Wnt/β-catenin信號網絡與干細胞自我更新和分化密切相關，可以控制干細胞的命運[31-32]。lncRNA肝癌高表達轉錄本(highly up-reglated in liver cancer，HULC)是各種人類疾病發展的重要調節因子，通過轉染改變BMSCs中HULC和miR-195的表達，發現HULC過表達可下調miR-195，增強Wnt/β-catenin信號通路的表達[33]。lncRNA-p21與Wnt/β-catenin也密切相關，Xia等[34]從8周齡和18個月大的雄性C57BL/6小鼠中分離出BMSCs，發現沉默老齡小鼠BMSCs中的lncRNA-p21后，通過Wnt/β-catenin途徑相互作用可以提高老齡化小鼠的BMSCs成骨能力。提示靶向調控lncRNA-p21可能對恢復老年個體中的內源性MSC具有重要的治療意義。另一項研究抑制了腫瘤低表達lncRNA(low expression in tumor，LET)，結果促進了BMSCs增殖，LET可負調控BMSCs中TGF-β1的表達，小濃度的TGF-β1通過激活Wnt/β-catenin途徑促進BMSCs的增殖[35]。因此，可通過抑制LET上調TGF-β1的表達，激活Wnt/β-catenin途徑，促進BMSCs增殖[32]。含BED型鋅指蛋白3(zinc finger BED-type containing 3，ZBED3)是MSC中表達最高的lncRNA之一，具有促進骨形成分化的能力。Hu等[36]成功建立了骨損傷模型，結果顯示，上調的ZBED3通過激活Wnt/β-catenin信號轉導途徑降低白細胞介素-1β的表達，從而促進BMSCs的分化和增強骨再生。這些研究從不同層面驗證了lncRNA參與了BMSCs的成骨分化，同時激活或抑制成骨相關蛋白的表達。

2.4TGF-β與lncRNA TGF-β是BMP超家族成員之一，在骨基質中高表達，與成骨細胞分化和骨發育密切相關，TGF-β對體外多種細胞的增殖和分化具有顯著影響，對骨吸收具有復雜的作用，可抑制破骨細胞的形成和破骨細胞活性[37]。SIRT1(sirtuin 1)能夠使β-catenin去乙酰化以促進其在細胞核中的積累，這與BMSCs分化相關的基因轉錄有關；此外，SIRT1在BMSCs向成骨細胞的分化中起關鍵作用，SIRT1激活及抑制化合物可分別增加和減少成骨細胞標志物和骨礦化的表達，提示SIRT1表達的變化與成骨細胞分化有關；而且，TGF-β配體激活TGF-β受體啟動Smad3信號，Smad3信號又可以協同激活SIRT1轉錄[38]。缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)是在缺氧感受與缺氧誘導方面發揮重要功能的轉錄因子，Xu等[39]研究人BMSCs中lncRNA HIF-1α成骨細胞分化，結果發現，TGF-β可抑制BMSCs中SIRT1的表達，低水平的SIRT1導致lncRNA HIF-1α上調，相反SIRT1的過表達導致lncRNA HIF-1α-AS1下調，通過促進乙酰化來增強同源異形盒D10(homeobox gene D10，HOXD10)的表達，而HOXD10表達在促進成骨細胞分化中起重要作用，因此TGF-β通過SIRT1和lncRNA HIF-1α-AS1導致BMSCs分化為成骨細胞。提示HIF-1α-AS1是成骨細胞分化的重要介質，并因此可以作為基因治療劑用于人骨疾病的治療。另外，lncRNA H19也與骨關節炎、骨質疏松息息相關，Huang等[40]發現，人BMSCs成骨分化后lncRNA H19顯著上調，H19可協調miR-675抑制TGF-β1信使RNA和蛋白的表達，而TGF-β1下調后可抑制Smad3磷酸化，該研究發現了一條新途徑，即H19/miR-675/TGF-β1/Smad3/組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)途徑，調節BMSCs的成骨分化。lncRNA H19作為競爭性內源RNA還可以調節Wnt/β-catenin途徑，這也揭示了lncRNA在協調骨生成中的作用[41]。

2.5促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號與lncRNA MAPK家族調控BMSCs的分化、礦化和增殖[42]。p38是MAPK通路的成員之一，是調節炎癥、細胞分化、細胞生長、死亡等多種過程的重要調控因子[43]。目前已有研究證實，p38 MAPK信號通路的激活是BMSCs成骨分化的關鍵觸發因子[44]。Zhang等[45]研究發現，lncRNA分化拮抗非蛋白編碼RNA(discrimination antagonising non-protein coding RNA，DANCR)參與了人來源的BMSCs的成骨分化，DANCR通過p38 MAPK通路調控增殖和成骨分化；為了闡明p38 MAPK對DANCR相關細胞增殖和成骨分化的影響，將轉染si-DANCR的BMSCs用特異性p38抑制劑SB203580處理，結果發現，DANCR上調導致p38 MAPK通路失活，DANCR與MAPK通路的關聯可能為骨形成分化調控機制提供新的見解。

骨質疏松癥是一種嚴重的慢性系統性骨質疏松疾病，其特征在于低骨密度(bone mineral density，BMD)和結構障礙。研究表明，BMSCs的異常分化是絕經后婦女骨質疏松癥發生的最根本原因，骨質疏松癥患者BMD低表達和β-Ⅰ型膠原羧基端肽(β-carboxyl terminal peptide of typeⅠcollagen，β-CTx)高表達[46]。Jiang等[47]通過實驗創建小鼠骨質疏松模型，測量小鼠脊柱的BMD、血清β-CTX水平和ALP活性，結果發現，BMD降低，β-CTx和核仁小分子RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1)表達增加。在成骨誘導劑刺激的BMSCs中，ALP活性和磷酸化p38蛋白水平升高，SNHG1表達下調；同時SNHG1過表達增強了神經前體細胞表達下調因子4(neural precursor cell down-regulation factor 4，NEDD4)和磷酸化p38之間的相互作用，破壞了磷酸化p38的蛋白質穩定性，并促進了磷酸化p38的泛素化，而泛素化又是一種重要的翻譯后調控機制，由泛素-活化酶(E1)、泛素綴合酶(E2)和泛素-連接酶(E3)介導[48]。已經證實，E3家族成員在成骨分化中發揮重要作用[49]。在E3泛素連接酶中，Nedd4可通過介導泛素化和降解骨肉瘤細胞抑制p38活化[50]。Jiang等[47]的實驗證明，lncRNA SNHG1通過Nedd4介導的泛素化負向調節p38 MAPK信號通路的調節機制，從而抑制BMSCs的成骨分化。Zheng等[51]也成功建立了SD大鼠骨質疏松模型，通過即時聚合酶鏈反應檢測lncRNA肺腺癌轉移相關轉錄因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)在骨質疏松大鼠和正常大鼠中的表達，培養并轉染BMSCs以建立MALAT1敲低模型，結果發現，lncRNA MALAT1在骨質疏松大鼠中低表達；此外，lncRNA MALAT1通過增強MAPK信號通路的激活來抑制BMSCs的成骨分化，從而促進骨質疏松癥進程。這些研究均表明lncRNA參與MAPK通路，從而影響BMSCs的成骨過程。

3 小 結

lncRNA在發育和分化過程中對基因表達的控制起著至關重要的作用。與miRNA不同，lncRNA可以折疊成復雜的二級結構和高階結構，為蛋白質和目標識別提供更大的潛力和通用性。多種lncRNA參與了BMSCs的成骨分化，lncRNA在調節BMSCs增殖方面顯示出令人鼓舞的趨勢，而且這些lncRNA與各種骨疾病有著不可分割的關系。通過闡述lncRNA相關的重要的成骨相關因子和信號通路，證明了lncRNA與BMSCs的成骨相關，而且這些lncRNA也與骨相關疾病密切相關。然而，lncRNA參與BMSCs病理過程中的具體調節機制，還需要進行深入的研究。