種植體表面改性對骨結合作用的研究進展

納飛，李自良，謝志剛

(昆明醫科大學附屬口腔醫院種植科，昆明 650500)

金屬鈦及其合金常被運用于口腔種植領域[1]，種植牙無需制備鄰牙，固位力和穩定性能極佳，且形態逼真，美觀，效果好，隨著人們生活水平和生活質量要求的提高，種植體植入逐漸成為牙列缺損修復的首選方法。種植體植入口腔牙槽骨中，骨結合的形成是種植體周圍軟硬組織形成并穩定的前提條件，也是種植體長期穩定的重要保障。為加快種植體表面骨結合的發生，提高種植體的種植成功率，生物化學改性是常用的方法之一[2]。研究發現，很多生物活性分子可運用到骨再生領域，加快新骨生成[3]，其作用機制可能是這些生物活性分子與體內的細胞因子、生長因子結合，并通過與細胞外的整合素、受體相作用，直接或間接影響細胞的增殖、遷移、黏附以及分化能力[4]。

種植體表面的生物化學改性是將具有生物活性的小分子蛋白采用特定的方法固定于種植材料表面[5]，通過誘導特殊細胞分化(成骨細胞、破骨細胞、間葉充質干細胞)和軟硬組織改造，加快骨結合的發生，如若將具有抗菌性能的小分子蛋白涂布于種植體表面，還可增強種植體表面的抗感染能力，提高種植體的長期穩定性。細胞外基質蛋白中的小分子活性蛋白精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid，RGD)肽、膠原蛋白Ⅰ、纖連蛋白、層粘連蛋白等具有促進成骨細胞增殖、遷移以及分化的作用[6-7]。RGD肽可通過分子橋與另一種小分子蛋白結合，層粘連蛋白可加快成骨細胞聚集于種植體表面。此外，可由成骨細胞分泌的小分子蛋白——骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)也有促進成骨結合發生的功效[8]。近年來學者們發現，RGD肽、膠原蛋白Ⅰ、BMP-2、纖連蛋白等小分子蛋白還可附著于鈦片或種植體表面，直接或間接促進成骨細胞增殖分化，加快骨形成[9]。現就RGD肽、膠原蛋白Ⅰ、BMP-2、纖連蛋白等小分子蛋白修飾于種植體表面后對骨結合作用的影響予以綜述。

1 RGD

RGD肽廣泛存在于細胞外基質蛋白中，細胞表面的整合素蛋白能識別并結合這個序列，從而介導細胞與細胞基質間的黏附，啟動細胞信號轉導，激活與生長、增殖相關的基因的轉錄，促進細胞代謝和蛋白質合成，增強細胞附著、增殖、分化和礦物質沉積。

Secchi等[10]的研究發現，RGD肽可通過抑制促凋亡蛋白酶的產生，促進成骨細胞黏附于種植體表面。Pagel等[11]研究發現，一種貽貝來源蛋白(mussel-derived peptide，MP)既能與RGD和肝素結合蛋白(heparin binding protein，HBP)結合形成MP-RGD-HBP肽，又能作為一種固定分子將MP-RGD-HBP固定于鈦片上。將人類骨肉瘤細胞(SaOS-2)分別置于附著MP-RGD-HBP、MP-RGD、MP-HBP的鈦片上培養，結果顯示，MP-RGD-HBP改善骨肉瘤樣細胞黏附、生存和增殖的能力明顯優于MP-RGD和MP-HBP。

RGD肽還可縮短成骨細胞附著于鈦片的時間[12]。Dayan等[13]的研究顯示，RGD肽可作為一種“分子橋”，將二氫硫辛酰胺脫氫酶蛋白吸附于鈦片，加快成骨的細胞黏附、增殖，促進其礦化。有研究發現，將RGD肽與具有抗菌性能的肽共同吸附于種植體表面，不僅可以加快骨結合的發生，還可增加種植體表面的抗菌性能[14]。有研究將羅紅霉素和RGD肽共同修飾于鈦片表面發現，其有效增強了成骨細胞在鈦片上的黏附能力，減少細菌在鈦片上的集聚黏附[6]。還有研究發現，線狀RGD肽與環狀RGD肽加快骨結合發生的能力不同，環狀RGD肽明顯強于線狀[15]。采用氧化鋯等瓷材料制作的種植體是近年研究的熱點，研究發現，RGD肽可附著于氧化鋯制作的種植體表面，并加快骨結合的發生[16]。

以上研究均表明，RGD肽不僅自身能加強成骨細胞黏附于鈦片或鈦基種植體表面，還可作為“連接蛋白”通過共價結合與另一種促進成骨細胞增殖的蛋白結合，進一步加快骨結合的發生。此外，RGD肽與另一種抗菌肽結合黏附于種植體表面，加快骨結合發生的同時也增強了種植體表面的抗菌能力，提高種植體的長期穩定性。提示RGD肽運用于口腔種植體生物化學改性方面有巨大潛力。

2 膠原蛋白Ⅰ

膠原蛋白Ⅰ是骨細胞基質的主要成分，大約占骨細胞基質蛋白的80%，可通過整合素β1通路提高細胞的黏附能力[17]。

Stadlinger等[18]的研究發現，膠原蛋白Ⅰ修飾的種植體在骨種植體界面上的成骨效果明顯優于對照組，表明膠原蛋白在體內有促進骨整合的作用。研究表明，在骨質不好的區域，膠原蛋白Ⅰ修飾的種植體可明顯加快骨結合的發生[19-20]。有學者采用化學方法將膠原蛋白Ⅰ吸附于鈦片表面發現，上皮細胞的增殖率和遷移率明顯高于對照組，提示膠原蛋白Ⅰ可運用于口腔種植美學領域[21]。Morra等[22]的研究顯示，膠原蛋白對早期骨整合有效。Costa等[23]研究了膠原蛋白對表面用納米技術處理的鈦片上培養的大鼠成骨細胞的影響，結果顯示，膠原蛋白的涂布增加了細胞的增殖和堿性磷酸酶的活性，同時提高了骨涎蛋白、骨橋蛋白、骨鈣蛋白等的表達，提示鈦片表面納米技術處理聯合膠原蛋白附著可促進骨生成。

對于疏松的骨質而言，Li等[24]將膠原蛋白Ⅰ和透明質酸復合修飾的種植體植入卵巢切除的骨質疏松小鼠中，結果發現，種植體表現出較好的生物相容性、成骨性能和抗破骨細胞性能。Zhang等[25]的研究表明，膠原蛋白Ⅰ、透明質酸以及阿司匹林復合的鈦面不僅有利于骨髓間充質干細胞的增殖、遷移和分化，還可減少巨噬細胞對炎癥的反應，同時還發現種植體周圍骨結合的發生明顯增強，因此認為膠原蛋白Ⅰ、透明質酸和阿司匹林修飾的種植體表面可調控骨結合和成骨免疫的發生。提示膠原蛋白Ⅰ和透明質酸復合修飾的種植體有應用于骨質疏松患者的潛力。

有研究采用天然膠連劑和原花青素將膠原蛋白Ⅰ固定于氧化鋅種植體表面也顯示出良好的成骨效果[26]。膠原蛋白Ⅰ附著于鎂-氧化鋯-鈣合金制成的種植體表面，種植體周圍新骨的生成也明顯增多[27]。

以上研究表明，膠原蛋白Ⅰ加快骨結合發生的作用明顯，膠原蛋白Ⅰ修飾的種植體可運用于骨質較差的種植區域，并能作用于上皮細胞，促進牙齦軟組織愈合，提示膠原蛋白Ⅰ能適當拓寬種植的適應證，提高種植體的成功率，延長種植牙的使用壽命。

3 BMP-2

BMP是轉化生長因子-β超家族成員，可由成骨細胞分泌，能促進間充質干細胞分化為成骨細胞或破骨細胞。

BMP-2附著于金屬種植體表面的方法有很多，主要有:采用磷酸鈣作為載體，與細胞外基質或殼聚糖混合；以肝素作為連接體；采用聚合電解質作為載體；BMP-2基因轉染以及采用納米管作為載體等[2]。有學者將納米微管和BMP-2聯合運用鈦片表面發現，成骨細胞的黏附、增殖、分化和成骨能力均有所增加[8]，運用納米微管的BMP-2種植體表面也可明顯加快種植體周圍骨結合的發生[28]。

研究發現，BMP-2促進了成骨細胞的分化、加快了骨結合的發生，可能是通過激活整合素和BMP/Smad通路實現的[29]。B?hrnsen等[30]發現，在骨質疏松大鼠模型中，BMP-2還可加快骨缺損的愈合，并在一定程度上加強種植體表面骨結合的強度。

Peterson等[31]研究發現，相對于纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)，BMP-2具有更好的成骨效果。為研究BMP-2在種植體表面的穩定釋放對成骨的影響，Hunziker等[32]將BMP-2置于一種類似于骨材料的三維晶體中，與磷酸鈣一起涂布在種植體表面，實驗結果顯示緩慢、持續釋放BMP-2有助于種植體周圍成骨，使成骨的過程更加安全、可靠，可縮短種植術后的愈合期。Yang等[33]認為，BMP-2和人生長分化因子-5在分子結構上有與肝素結合的特殊位點。有研究探索了BMP-2和人生長分化因子-5這兩種細胞因子聯合運用對成骨效應的影響發現，成骨細胞MC3T3-E1在人生長分化因子-5和BMP-2共同修飾的界面上表現出了較高的增殖率、堿性磷酸酶活性，同時膠原蛋白Ⅰ和骨橋蛋白信使RNA的表達也明顯高于單獨使用分化因子-5和BMP-2組，提示人生長分化因子-5和BMP-2聯合使用能明顯加快成骨細胞的成骨效應。也有研究聯合運用DNA寡核苷酸和BMP-2也取得了較好的骨誘導效應[30]。

比較BMP-2/羥磷灰石復合物和臨床上常用的牛骨制作的人工骨粉的成骨作用發現，BMP-2/羥磷灰石復合物的骨誘導作用較好[34]。另有研究發現，BMP-2能促進放射治療后種植體表面骨結合的發生，且BMP-2與血管內皮生長因子聯合使用時效果最佳，提示BMP-2有適當拓寬臨床種植適應證的潛力[35]。

BMP-2附著于種植體表面的量可能也會影響骨結合的效率。Guillot等[36]研究了大劑量BMP-2(9.3 μg)對成骨效應的影響發現，BMP-2修飾的種植體表面的骨整合效果明顯低于無BMP-2附著組，但是在BMP-2修飾組中種植體上部的空心部位卻顯示出了相對較高的骨生長，由此認為大劑量的BMP-2可能會導致局部、暫時的骨損壞，涂布在種植體上的BMP-2的劑量需要謹慎選擇。有學者認為，種植體表面BMP-2為15 μg時效果較好[37]。

近年來有學者對BMP-2促進骨結合發生的作用提出了質疑，研究發現，將BMP-2附著于種植體表面并不能促進新骨形成和加快骨結合發生[38-40]。有研究將涂布BMP-2的種植體植入骨缺損動物的牙槽骨中，并同期植入異體骨移植材料發現，BMP-2修飾組種植體的機械強度和骨移植材料的吸收率均弱于對照組，提示BMP-2并不適用于植骨并同期種植手術[41]。

BMP-2可有效加快種植體表面骨結合的發生，而其與另一種支架材料(羥磷灰石、磷酸鈣)的聯合運用是近年來學者們研究的熱點，但也有學者對此提出了質疑。

4 纖連蛋白

纖連蛋白是細胞外基質蛋白的一種，細胞內含有RGD肽鏈，可與細胞表面的整合蛋白結合，促進細胞與生物材料的黏附。纖連蛋白修飾的鈦片可促進成骨細胞增殖、分化和礦化[42]。

Rapuano等[7]將成骨細胞置于纖連蛋白修飾的鈦片上培養，結果發現，培養最初10 d成骨細胞增殖的最快，第10～20天成骨細胞的分化能力開始增強，第20～36天成骨細胞的礦化能力最強。Cho等[43]的研究顯示，纖連蛋白來源的寡肽的促成骨作用可能與細胞外調節蛋白激酶信號通路有關，可作為一種穩定的生物分子用于種植體表面改性，以促進成骨作用的發生。在動物實驗中，Agarwal等[44]將纖連蛋白附著的種植體植入小鼠頜骨中，結果發現，種植體的穩定性在第1個月和第3個月時與對照組相比分別提高了57%和32%，證實了纖連蛋白附著的種植體可加快骨整合的發生[45-46]。此外，MacDonald等[47]的研究也發現，與對照組相比，纖連蛋白附著的種植體的抗剪切能力提高了3～5倍。

Horasawa等[42]將纖維蛋白原和纖連蛋白復合在鈦板表面，將成骨細胞置于這種界面上生長，與對照組相比，成骨細胞的增殖率明顯增高，BMP的表達量也明顯增加。提示纖鏈蛋白修飾的鈦表面可促進骨形成，從而加快種植體與骨的整合。纖連蛋白與BMP-2的復合使用對骨整合的發生也有積極作用[48]。Brigaud等[49]比較纖連蛋白/BMP-6和纖連蛋白/BMP-2的成骨效應的研究發現，纖連蛋白/BMP-6促骨整合的效果最好。另有研究比較磷酸鈣和纖連蛋白共同修飾的種植體與酸蝕處理的種植體的成骨效果發現，磷酸鈣和纖連蛋白共同修飾的種植體表面的骨結合較好、骨密度較高[50]。此外，有研究還比較了線性RGD、環狀RGD與纖連蛋白的成骨效果發現，纖連蛋白可有效促進成骨細胞附著于鈦片，加快成骨作用的發生[51]。

以上研究證實，纖連蛋白可加快成骨細胞附著于鈦片或種植體表面，加快骨結合的發生，纖連蛋白與其他生長因子/蛋白的聯合應用是近年來學者的研究熱點。

5 層粘連蛋白

層粘連蛋白是一種屬于細胞外基質蛋白的糖蛋白，能與細胞外的整合素結合，可通過整合素β1調節細胞的黏附作用，招募成骨細胞聚集。有研究者發現，層粘連蛋白-1有促進磷酸鹽成核的作用[52]。

Bougas等[53]將層粘連蛋白-1和種植體復合后植入家兔的股骨中，結果顯示，層粘連蛋白-1能明顯增強種植體周圍骨的整合。Schwartz-Filho等[54]將層粘連蛋白-1和種植體復合后植入家兔的脛骨中發現，成骨細胞的標志物成骨特異性轉錄因子-2、骨鈣素、堿性磷酸酶、膠原蛋白原-1基因的表達明顯升高，提示層粘連蛋白-1可加快種植體表面新骨的生成。此外，Atsuta等[55]發現，層粘連蛋白附著的種植體可加快上皮與種植體的結合，形成良好的生物學封閉，提高種植體的種植成功率。Min等[56]的研究顯示，層粘連蛋白-1可促進成骨細胞黏附，縮短種植體植入后的愈合時間。Heller等[57]研究也發現，采用等離子聚合的方法將層粘連蛋白修飾于鈦表面，可延長生物分子的作用時間。還有研究發現，層粘連蛋白-2來源的肽DLTIDDSYWYRI修飾的種植體可加快骨結合的發生[58]。Yeo等[59]的研究也發現，層粘連蛋白-2來源的肽Ln2-LG3-P2-DN3可加快成骨分化，并加快種植體周圍新骨的形成。

以上研究表明，層粘連蛋白及其來源的肽均可加快種植體周圍骨結合的發生，提示層粘連蛋白有運用于種植體周圍生物化學改性的潛能。

6 釉原蛋白

釉原蛋白存在于造釉細胞和釉質界面上，具有促進細胞黏附的作用。Beyeler等[60]將釉原蛋白的活性位點縮短為一條含13個氨基酸的肽鏈，這段肽鏈不直接與細胞外的受體結合，而是先與纖連蛋白交互，再與細胞外的受體結合，因此認為這段活性肽鏈附著的種植體表面能促進纖連蛋白的集聚，然后促進細胞在種植體表面黏附，加快骨結合的產生。Du等[61]將成骨細胞置于釉原蛋白和磷灰石復合的鈦片上培養發現，細胞的黏附、增殖和分化能力均有所增強，提示釉原蛋白有運用于口腔種植和生物材料等領域的潛能。

在動物實驗方面，Terada等[62]的研究也證實了釉原蛋白不僅可加快牙髓干細胞黏附在鈦片上，還能增強其分化能力，同時還發現釉原蛋白附著的種植體可促進種植體周圍骨結合的發生。

7 其 他

彈性蛋白可促進上皮細胞、成骨細胞、脂肪細胞的黏附和增殖[63-64]。Raphel等[64]發現，彈性蛋白可加快成骨細胞附著于鈦面，并促進其分化和礦化。體外實驗發現，植入早期(1周)，彈性蛋白修飾組的骨-種植體接觸面積和界面強度均高于對照組[65]。

玻連蛋白是一種細胞基質蛋白，可與生長因子、蛋白酶和蛋白酶抑制劑/受體相互作用。Ravanetti等[66]將一種類似于玻連蛋白的多肽附著于種植體表面，并植入大鼠股骨中發現，骨結合的發生明顯高于對照組，認為這可能與玻連蛋白能加快種植體表面成骨細胞的募集和激活有關。此外，有研究將成骨細胞置于黏附玻連蛋白和纖連蛋白的鈦片上培養，結果發現，成骨細胞的黏附、增殖能力均有所增強[67]。

DNA是一種生物大分子，可組成遺傳指令，DNA分子的功能是貯存決定物種的所有蛋白質和RNA結構的全部遺傳信息，能表達生物活性蛋白的DNA也可加快成骨細胞的增殖和分化。Jiang等[68]將BMP-2的DNA通過一定的方法復合到鈦板表面，將MC3T3-E1細胞置于這種界面上生長，結果發現，MC3T3-E1細胞能分泌BMP-2，并且在成骨分化早期BMP-2分泌的最多。Hu等[69]研究發現，殼聚糖和含有綠色熒光蛋白及人BMP-2基因的質粒DNA復合修飾的鈦面，有助于間質干細胞分化為成熟的骨細胞。

8 小 結

鈦基種植體表面的生物化學改性不僅能提高種植體周圍的骨結合，若聯合運用具有促成骨作用的生物蛋白因子與具有抗菌性能的肽鏈，還可降低細菌的黏附和增殖。目前多方向、多種蛋白因子聯合應用(如采用層層自組裝技術將殼聚糖和BMP-2同時加載于種植體表面)，進一步提高種植體周圍組織的骨結合和抗感染能力是當前的研究趨勢。目前國內外關于此方面的報道大多基于動物實驗與體外實驗，如運用于臨床，還需要更進一步研究如何控制生物分子在種植體表面的穩定釋放。