斑馬魚白血病模型的研究進展

向文碧，何志旭，舒莉萍

(1.貴州醫(yī)科大學細胞工程生物醫(yī)藥技術國家地方聯(lián)合工程實驗室 組織工程與干細胞實驗中心，貴陽 550004； 2.中國醫(yī)學科學院成體干細胞轉化研究重點實驗室，貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學兒科學教研室，貴陽 550004； 4.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科學教研室，貴州 遵義 563004)

白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病，通常來源于骨髓。 2015年，有超過230萬患白血病的患者，全球超過350 000人死于白血病[1]。在美國，2017年有62 130例新發(fā)白血病病例，白血病導致24 500例死亡，白血病患者的5年生存率約為63%[2]。雖然大多數(shù)白血病累及成人，但白血病也是兒童癌癥中最常見的診斷。白血病主要按兩個標準分類，按起源細胞分類：淋巴起源的白血病被稱為“淋巴細胞性或淋巴細胞系白血病”，而骨髓來源的白血病被稱為“骨髓性或髓系白血病”；根據(jù)生長速度分為急性白血病和慢性白血病。白血病的發(fā)病原因多種多樣，一些與染色體異常直接相關(如慢性髓系白血病中的費城染色體)，一些白血病涉及血細胞生長、分化和存活相關的多個基因的突變和(或)易位。然而，大多數(shù)白血病的病因不明，尚有一些患者無染色體異常且無已知的基因突變，突出了需要在動物模型中進一步研究以揭示這些未知的造血系統(tǒng)惡性腫瘤的驅動因素。現(xiàn)就斑馬魚白血病模型的最新研究進展予以綜述。

1 斑馬魚模式生物的生物學優(yōu)勢

斑馬魚是一種淡水硬骨魚，自20世紀70年代有學者首次使用斑馬魚作為模型生物[3]以來，越來越多的實驗室開始使用這種強大的生物來研究發(fā)育和疾病，因為它具有許多優(yōu)于其他模式生物的優(yōu)勢。首先，斑馬魚體外受精，胚胎通體透明，易于觀察和進行實驗操作；另外，斑馬魚發(fā)育迅速，大多數(shù)主要器官在受精后2～3 d形成，3個月左右達到性成熟，一次繁殖可產(chǎn)生數(shù)百枚胚胎[4]，使得斑馬魚成為用于大規(guī)模篩查的理想模型。

斑馬魚在血液系統(tǒng)關鍵發(fā)育過程的高度保守使人們能夠識別出與人類造血功能障礙有關的幾個基因[5]。此外，由于白血病細胞的特殊性，使用熒光蛋白標記可視化轉基因斑馬魚體內的白血病發(fā)生過程，將有助于進行白血病的研究。與小鼠的給藥方式相比，斑馬魚可以直接從水中攝入小分子化合物，方便快捷，易于對藥物進行高通量篩選。通過轉基因斑馬魚篩選程序鑒定小分子將有助于開發(fā)用于治療疾病(特別是癌癥)的新型藥物。因此，轉基因斑馬魚在造血、造血系統(tǒng)疾病和白血病的研究方面具有很好的前景。

在患有免疫功能低下的小鼠中進行異種移植是一種具有代表性的體內研究方法，用于研究惡性血細胞生成的生物學以及開發(fā)針對血液疾病的新療法[6-7]。然而，由于小鼠實驗的局限性(包括實驗程序的時間安排和動物房的設施成本)，小鼠模型不適合用于對潛在候選藥物進行快速、經(jīng)濟有效的篩查；此外，免疫抑制可以改變造血微環(huán)境，從而影響腫瘤細胞的行為和對治療的反應[8]。與其他脊椎動物模型系統(tǒng)相比，用斑馬魚胚胎進行異種移植可提供許多優(yōu)點：斑馬魚在受精后4周缺乏成熟的適應性免疫系統(tǒng)，允許移植且不需要免疫抑制[9]；斑馬魚是光學透明的，并且與注射的細胞一樣，可以用各種熒光染料特異性標記，達到體內細胞-細胞相互作用的可視化；斑馬魚繁殖迅速且價格低廉，允許進行高通量藥物篩查[10]。目前，通過斑馬魚藥篩體系篩選出的藥物已進入臨床試驗[11]。

2 斑馬魚的正常造血過程

斑馬魚造血發(fā)育主要有原始造血和定向造血兩個階段[12]。原始造血在受精后24 h從兩個位置產(chǎn)生，前側板中胚層產(chǎn)生骨髓譜系，中間細胞團產(chǎn)生原始骨髓和紅細胞，然后，原始骨髓細胞在卵黃囊周圍遷移并分化成不同的骨髓譜系[13]。定向造血能夠產(chǎn)生和重建整個造血系統(tǒng)的造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，從受精后26 h開始，定向HSCs從主動脈-性腺-中腎(aorta-gonad-mesonephros，AGM)區(qū)域背主動脈的血源性內皮細胞中出現(xiàn)，然后HSCs在受精后48 h遷移至尾部造血組織，這是后血島的擴張，并且作為瞬時造血部位產(chǎn)生紅細胞、骨髓細胞和血小板，來自AGM區(qū)域的HSCs約在受精后48 h定殖于腎髓[14]。斑馬魚腎髓與哺乳動物骨髓相似，可產(chǎn)生所有的成熟血液細胞譜系，包括胚胎和成年斑馬魚的紅系、髓系和淋系[15]。在大約受精后54 h時，來自AGM區(qū)域的淋巴樣祖細胞轉移到胸腺，即淋巴T細胞成熟的位置，盡管造血部位存在差異，但斑馬魚的每個造血過程與哺乳動物一樣都是非常保守的[15-16]。

3 斑馬魚白血病模型的研究進展

斑馬魚和人類造血發(fā)育高度保守[17]，利于造血系統(tǒng)惡性腫瘤斑馬魚模型的發(fā)展，有助于闡明惡性腫瘤的分子發(fā)病機制，并加快新療法的臨床前研究[18]。

3.1淋系白血病的斑馬魚模型 第一個急性T淋巴細胞白血病(acute T-lymphocytic leukemia，T-ALL)轉基因斑馬魚模型是由Langenau等[19]通過將小鼠c-Myc基因與增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因融合，以淋巴細胞特異性啟動子rag2驅動EGFP-mMyc融合基因的表達而構建的。該模型首次在熒光顯微鏡下監(jiān)測EGFP標記的白血病細胞的發(fā)生過程。然而，由于該轉基因魚(30日齡)中白血病發(fā)病非常迅速，因此，很難長期觀察和研究白血病的發(fā)生、發(fā)展。為了克服這個問題，該組構建了一個條件轉基因斑馬魚系，在EGFP-mMyc致癌基因前面加一個loxed dsRED2基因，通過Cre介導的LoxP-dsRED2-loxP重組盒控制c-Myc的表達[20]。該魚未注射Cre信使RNA重組酶時，表達紅色熒光，不會發(fā)生白血病。通過將Cre信使RNA注入單細胞期胚胎，可以誘導轉基因后代發(fā)生T-ALL。

Myc致癌轉錄因子在大多數(shù)T-ALL病例中過表達，人第10號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)通路中的基因突變在T-ALL中也是常見的。Gutierrez等[21]構建了T-ALL的第二個條件轉基因斑馬魚模型，該模型不是基于Cre/lox系統(tǒng)而是由他莫昔芬誘導，在該條件轉基因斑馬魚模型中，用4-羥基他莫昔芬誘導后，Myc被激活，從而使斑馬魚發(fā)生T-ALL，并且4-羥基他莫昔芬的撤除導致T-ALL細胞凋亡和腫瘤消退；同時還發(fā)現(xiàn)，斑馬魚PTEN基因的功能缺失突變或組成型活性Akt2轉基因的表達在4-羥基他莫昔芬撤除后可促進疾病進展；此外，Myc降低了PTEN在信使RNA水平的表達，表明Myc下游的PTEN-PI3K-Akt通路激活是腫瘤進展的原因。通常在T-ALL中激活的另一途徑是Notch途徑。為了研究Notch信號轉導激活后誘導白血病的分子機制，Chen等[22]構建了由人Notch1誘導的T細胞白血病斑馬魚模型，在該模型中，rag2啟動子驅動Notch1的胞內部分表達，從而誘導疾病發(fā)生，44%的斑馬魚在誘導約5個月時發(fā)生T淋巴細胞增生性疾病，腫瘤細胞廣泛侵入斑馬魚的所有組織，將誘導斑馬魚中的腫瘤細胞移植到受輻射的受體斑馬魚中時，受體斑馬魚發(fā)生侵襲性和致命性白血病；此外，當該轉基因系與另一種過表達斑馬魚Bcl-2基因系雜交時，白血病發(fā)病顯著加速，表明Notch途徑和Bcl-2介導的抗凋亡途徑之間有協(xié)同作用。通過這些轉基因斑馬魚模型人們已經(jīng)對白血病的發(fā)病機制產(chǎn)生了重要的見解，并且這些模型已經(jīng)用于化學篩選和移植實驗，旨在進一步認識T-ALL的生物學過程。

3.2髓性白血病的轉基因斑馬魚模型 在斑馬魚ALL模型取得初步成功之后，科研工作者開始努力在斑馬魚中重現(xiàn)髓系惡性腫瘤，包括骨髓增生性腫瘤(myeloproliferative neoplasms，MPN)和急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)。許多血液系統(tǒng)惡性腫瘤由染色體轉位后產(chǎn)生的致癌融合基因驅動。染色體轉位后產(chǎn)生的這些融合基因通常可以在動物模型或細胞系中表達以驅動腫瘤發(fā)生。因此，大多數(shù)MPN和AML轉基因斑馬魚系是通過在斑馬魚體內表達人類常見的致癌融合基因和突變基因所構建的。有學者用啟動子spi-1驅動EGFP和MYST3/NCOA2融合基因的表達構建了AML的第一個轉基因斑馬魚模型，證明了MYST3/NCOA2融合基因的致癌效力；在斑馬魚胚胎單細胞期注射MYST3/NCOA2-EGFP融合基因后14和26個月，表達MYST3/NCOA2-EGFP的轉基因斑馬魚中有1.1%發(fā)生了AML，這種白血病的特征在于骨髓原始細胞對轉基因斑馬魚腎臟的廣泛侵襲[23-24]。

NUP98-HOXA9融合基因[t(7; 11) (p15; p15)]與AML和慢性粒細胞白血病的預后不良有關[25]。Forrester等[26]用spi-1啟動子驅動NUP98-HOXA9融合基因表達構建了Cre/lox誘導型轉基因斑馬魚系(spi1:loxP-EGFP-loxP；NUP98-HOXA9)；在胚胎期，NUP98-HOXA9過表達導致NUP98-HOXA9轉基因斑馬魚造血功能改變，包括髓樣細胞大量擴增、紅細胞減少和骨髓分化抑制；在成年期，23%的NUP98-HOXA9轉基因斑馬魚在19～23個月時發(fā)展成MPN。

在髓系惡性腫瘤中，HRAS基因突變比KRAS基因突變更頻繁，而NRAS基因突變很罕見，但在AML中NRAS基因經(jīng)常上調且被認為是AML不良的預后標志物[27-28]。Alghisi等[27]在造血出現(xiàn)之前誘導HRAS突變基因在生血內皮中表達構建了轉基因斑馬魚系(fli1：GAL4-FF；UAS-GFP-HRASG12V)，這個轉基因系斑馬魚尾部造血組織顯著擴增，未成熟的造血細胞數(shù)量增加以及腎髓中出現(xiàn)骨髓分化塊，與人類MPN類似。Shen等[29]創(chuàng)建了表達鼠n-Myc基因同時驅動EGFP表達的熱休克反應性轉基因斑馬魚系MYCN：HSE：EGFP，在熱休克后，n-Myc過表達促進未成熟的髓樣細胞擴增，并增強骨髓細胞的再增殖活性。

核磷蛋白1(nucleophosmin 1，NPM1)的突變發(fā)生在約27%的AML病例中[30-31]，而FMS樣酪氨酸激酶3(fms-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3)基因內部串聯(lián)重復突變(internal tandem duplication，F(xiàn)LT3-ITD)也是AML中的常見突變，與預后不良和復發(fā)風險增加相關[32-33]。Lu等[34]試圖通過構建spi1啟動子驅動的spi1：FLT3-ITD-2A-EGFP和spi1：NPM1-Mut-PA兩個轉基因斑馬魚系來研究AML中這兩種突變的相互作用，F(xiàn)LT3-ITD突變體6個月時出現(xiàn)中度髓樣高纖維化，其中一部分魚在9個月時發(fā)展為白血病，NPMc+突變體具有正常的造血組成，然而，F(xiàn)LT3-ITD和NPMc+的雙突變體在6個月內進展為白血病，證明它們在驅動AML中具有協(xié)同作用。

c-cbl基因經(jīng)常在MPN和急性白血病中發(fā)生突變，并通過抑制生長因子和細胞因子信號起到腫瘤抑制因子的作用。通過大規(guī)模的乙酰基亞硝基脲誘變篩選，Peng等[35]最終確定了一個在造血器官中人HSCs顯著增加的系，該系發(fā)生了c-cbl基因突變，被命名為LDD731：CBLH382T；該突變在-15 dpf時是純合致死的，并導致定向造血中骨髓/紅細胞譜系的擴增；與在小鼠和人中觀察到的一致，在該系中FLT3對于骨髓/紅細胞譜系的擴增是必需的，表明FLT3信號轉導促進人HSCs增殖并且受c-cbl調節(jié)。

cAMP應答元件結合蛋白(cAMP response binding protein，CREB)是AML中另一種經(jīng)常上調的基因，然而，尚不清楚其單獨的過表達是否足以誘導白血病的發(fā)生。Tregnago等[36]用spi1啟動子構建了一個過表達CREB的斑馬魚模型，在該模型中，79%轉基因成魚的骨髓細胞生成中斷，66%進展為單核細胞白血病(潛伏期9～14個月)，該模型顯示出與20個兒科AML有關的差異表達基因相同的轉錄特征，包括CCAAT-增強子結合蛋白δ。

為了研究干擾素調節(jié)因子8(interferon regulatory factor 8，IRF8)在骨髓瘤形成發(fā)病機制中的作用，Zhao等[37]通過功能性敲除IRF8創(chuàng)造了一個錯義突變IRF8Δ57/Δ57，IRF8是骨髓譜系分化的關鍵轉錄調節(jié)因子，與髓系白血病密切相關，IRF8突變體骨髓異常增生，移植后復發(fā)，并侵入骨髓，迅速形成MPN，骨髓異常增生是由增殖增加和細胞凋亡減少引起的；在IRF8突變體中，c-Mer原癌基因酪氨酸蛋白激酶的表達增加，從而導致胞外信號調節(jié)激酶途徑的過度活化，最終導致骨髓瘤形成，并且敲低c-Mer原癌基因酪氨酸蛋白激酶可逆轉IRF8突變體的骨髓擴張。這些研究提示，c-Mer原癌基因酪氨酸蛋白激酶信號轉導過程在IRF8介導的髓樣增殖和生存調節(jié)中是關鍵的。

基于大多數(shù)白血病癌基因對造血功能產(chǎn)生的影響可早期檢測以及斑馬魚模型的一些固有優(yōu)勢，可以用白血病轉基因斑馬魚模型的胚胎開發(fā)藥物篩選。Yeh等[38]用熱激蛋白70啟動子控制AML1-ETO融合癌基因的表達開發(fā)了一種藥篩模型，在這個模型中，當發(fā)生熱休克后，胚胎中大量未成熟胚細胞累積，Runx1(Runt related transcription factor 1)和c-Myb表達消失，定向造血功能被破壞，表達gata1的紅系細胞消失，并最終導致髓系細胞異常擴增。以上這些影響都是AML1-ETO抑制scl所導致的，并且可以通過scl過表達逆轉。表達AML1-ETO的斑馬魚胚胎的轉錄特征與人類AML的轉錄特征類似，根據(jù)斑馬魚胚胎造血受影響的情況和AML轉錄特征，該研究組進行了可以逆轉AML1-ETO效應的抑制劑的化學篩選[39]。

3.3人源白血病的斑馬魚異種移植模型 腫瘤移植是了解癌癥病理生理學的重要技術。鑒于其超強的繁殖力和獨特的成像優(yōu)勢，斑馬魚成為理想的移植模型。Pruvot等[40]是建立斑馬魚異種移植模型以探索不同抗白血病藥物功效和毒性的早期研究者，他們通過將不同的、從AML患者體內分選出來的白血病細胞系(包括K562、Jurkat和NB4細胞)注射到48 hpf斑馬魚胚胎的卵黃囊中進行了一系列實驗，值得注意的是，用熒光標記的腫瘤細胞在斑馬魚胚胎的循環(huán)系統(tǒng)中保留數(shù)天而不影響它們的發(fā)育，移植K562細胞的受體魚進行甲磺酸伊馬替尼藥物處理后K562細胞數(shù)量減少。為了更好地量化藥物治療后白血病的緩解，Corkery等[41]開發(fā)了一種有效的方法來測量移植后斑馬魚胚胎中腫瘤細胞的數(shù)量變化，簡而言之，在異種移植和藥物處理后，將胚胎酶促解離成單細胞懸浮液，然后，經(jīng)過核共染色后在顯微鏡下計數(shù)懸浮液中熒光細胞的數(shù)目，以確認白血病細胞的計數(shù)。在白血病中，白血病干細胞的消融對于永久地根除白血病細胞群是必要的，然而，由于白血病細胞群中可用于動物建模的白血病干細胞數(shù)量非常少，以及白血病干細胞的病理生理功能無法在培養(yǎng)條件下得到證實，白血病干細胞抑制劑開發(fā)困難。Zhang等[42]開發(fā)了一種新的基于表型的白血病干細胞斑馬魚異種移植檢測方法，從用熒光蛋白標記的K562細胞中純化醛脫氫酶陽性細胞，然后將其移植到受精后48 h的斑馬魚胚胎中，移植后24 h，用不同治療藥物處理受體斑馬魚，通過高含量細胞分析成像判斷癌細胞增殖和細胞遷移，在測試的藥物中，除Imatinib和Dasatinib外，所有藥物均選擇性抑制白血病干細胞異種移植斑馬魚中的醛脫氫酶陽性細胞增殖和腫瘤細胞遷移。總之，以上這些研究提供了令人信服的證據(jù)，即在斑馬魚胚胎中進行血液腫瘤細胞移植可能是藥物研發(fā)的有用工具，也是定義患者特異性療法的預測平臺。

4 小 結

自2003年第一個斑馬魚T-ALL模型誕生[19]以來，斑馬魚對白血病的研究做出了巨大貢獻。目前已經(jīng)構建了多種不同的轉基因斑馬魚來模擬各種人類造血系統(tǒng)惡性腫瘤疾病。研究人員利用斑馬魚進行了小分子藥物高通量篩選，并鑒定了多種具有抗白血病活性的藥物，包括Nimesulide、lenaldekar和Perphenazine[39，43-44]。用斑馬魚模型進行疾病研究的進展消除了之前關于它們在癌癥研究中實用性的初步懷疑。展望未來，可以使用斑馬魚進行更多的研究。雖然目前能成功地用斑馬魚胚胎進行小分子藥物篩選，但篩選過程仍然受限于需將胚胎手動分配到各個組以及異種移植模型時需手動進行胚胎注射。未來這些程序的自動化和標準化將實現(xiàn)真正的高通量小分子篩選，最終促進個性化醫(yī)療。