垂體泌乳素腺瘤的動物模型和發病機制研究進展

王雄，馬莉，吳金虎

(武漢大學附屬同仁醫院 武漢市第三醫院藥學部，武漢 430060)

垂體瘤是常見的顱內腫瘤，占顱內腫瘤發病率的15%，泌乳素腺瘤是最易發生的垂體瘤，在各種類型的垂體腫瘤中，泌乳素腺瘤的所占比例高達67%[1]。泌乳素腺瘤是發生于垂體前葉的泌乳素上皮細胞腫瘤，是由泌乳素細胞瘤分泌過量泌乳素而導致的神經內分泌相關疾病。根據腫瘤的大小，可分為微腺瘤(直徑<1 cm)、大腺瘤(直徑為1～3 cm)和巨大腺瘤(直徑>3 cm)；按其侵襲性，有侵襲性腺瘤和非侵襲性腺瘤之分。泌乳素腺瘤典型的臨床表現為：女性閉經、溢乳、高泌乳素血癥、不育等；男性乳房發育、性功能減退、陽痿等；另外，侵襲性的腫瘤還會侵犯周圍神經結構和組織而引起其他的癥狀和病變。目前，國內治療藥物僅有溴隱亭一種，溴隱亭治療效果顯著，但價格昂貴，且存在一定的不良反應(如胃腸道反應)，劑量較大時可有眩暈、直立性低血壓、頭痛、瞌睡及便秘等；20%的泌乳素腺瘤患者經溴隱亭治療后出現耐藥現象，對溴隱亭耐藥或對其不良反應不耐受的患者，尚無替代治療藥物[2-3]。近年來，垂體泌乳素腺瘤的研究取得了一定進展，但其發病機制目前尚不完全清楚，同時臨床治療藥物也有限。現就垂體泌乳素腺瘤動物模型和發病機制的研究進展予以綜述。

1 垂體泌乳素腺瘤的動物模型

1.1雌激素誘發垂體瘤模型 雌激素誘發垂體瘤是目前最常用的垂體泌乳素腺瘤造模方法，造模時間較短，費用較低，模型穩定可靠。切除雌性大鼠卵巢后，通過攝入外源性雌激素使垂體泌乳素腺瘤生長，此模型與人類泌乳素腺瘤高度相似，便于探索疾病的發病機制。雌激素誘發垂體瘤模型使用的大鼠品系主要有F344(fischer 344)[3]大鼠和Wister(wistar-furth)[4]大鼠，BN(brown norway)大鼠和Holtzman大鼠難以通過此方法成功造模[5]，主要原因可能是不同品系大鼠對雌激素敏感性存在一定的差異。其中，給予雌激素誘導幾周后，F344大鼠腺體異常增長，血清泌乳素水平也顯著增高[3]。F344品系大鼠對雌激素敏感，造模周期較短，模型較穩定，一般情況下選擇此品系大鼠進行造模。

1.2轉基因動物垂體瘤模型 近年來，隨著分子生物學的迅速發展，對泌乳素腺瘤的分子生物學研究也逐漸深入。研究發現，內分泌類腫瘤形成的根本原因可能是基因突變的結果[6]，垂體泌乳素腺瘤的形成與許多基因的調控相關[7]。目前開發的轉基因模型制備方法是利用CRISPR/Cas系統將小鼠的某個基因敲除或將某個基因敲入特定的DNA區域，然后通過直接顯微注射獲得目標模型動物[8-9]。這是目前基因工程應用中的一種最簡便、可靠、高效的造模方法，在特定基因對腫瘤影響的研究中十分有效。Seruggia和Montoliu[10]研究證實，多巴胺D2基因敲除小鼠可用于制備穩定可靠的泌乳素腺瘤模型。Recouvreux等[11]通過用胚胎干細胞中D2基因靶向誘導雌性Drd2-/-小鼠，然后與野生型的雄性小鼠交配來進行擴繁，通過對小鼠的基因組DNA進行聚合酶鏈反應來鑒定 Drd2+/+、雜合子和Drd2-/-的小鼠，這種模型通常在動物在8月齡時使用，此時Drd2-/-雌性小鼠垂體增生，腺瘤形成。

1.3可移植性垂體瘤模型 近年來，可移植性腫瘤模型的發展越來越成熟。目前，可移植垂體瘤模型按移植部位主要分為皮下移植、腎囊內移植和顱內移植3類[2]。主要是將供體腫瘤組織或經原代培養的腫瘤細胞移植到受體體內，并保證腫瘤正常生長。可移植性腫瘤模型受體無需雌激素誘導，腫瘤可在受體內生長迅速，便于實驗觀察分析。Missale等[12-13]成功將人類泌乳素腺瘤細胞移植到裸鼠皮下，但未進行后續穩定性研究。可移植性腫瘤模型與人類泌乳素腺瘤有一定的差別，且并非所有雌激素誘發的垂體瘤都有可移植性[13]，故仍需探索更加優良的可移植瘤模型。

1.4自發性垂體瘤模型 動物自發性垂體瘤與人類泌乳素腺瘤較相似，但發生率較低，造模周期較長。研究發現，一些小鼠(C3H)和大鼠(SD)可產生自發性垂體瘤，Wistar大鼠也可產生自發性垂體瘤，但存在性別和年齡差異，雌性較雄性大鼠腫瘤發生率高，年齡越大腫瘤的發生率越高，但總體發生率較低，50周齡以下Wistar大鼠幾乎不發病[14]。其他品系大鼠自發垂體瘤的發生率很低，F344大鼠自發性垂體瘤發生率為20.5%，CD-1大鼠的發生率為1.1%[15-16]。故自發性垂體腫瘤模型雖具有一定優勢，但構建周期較長，垂體瘤發生率較低，且不便觀察，目前較少應用。

2 垂體泌乳素腺瘤的發病機制

泌乳素腺瘤發生于垂體前葉，垂體前葉整合了控制甲狀腺、腎上腺等生殖和生長功能的激素信號通路。垂體通過促進激素分泌調控內環境的穩態，但所獲得的垂體信號也會引起塑形的垂體生長反應，包括功能性垂體細胞發育不良、過度增生和腺瘤形成等[17]。目前泌乳素腺瘤的發病機制尚不完全清楚，主要有幾種理論假設，包括雌激素/受體機制、基因的異常表達以及細胞因子、受體和信號通路的異常調節、微RNA(microRNA，miRNA)的調控等。

2.1雌激素/受體機制 雌激素可直接穿越細胞核膜，與相應的核受體結合，形成二聚體作用于靶基因，啟動或修飾基因轉錄，上調相關基因表達。GH3/B6/F10 細胞膜雌激素受體(estrogen receptor，ER)豐富，給予10 nmol/L雌激素則細胞內鈣離子水平增加；1 pmol/L和1 nmol/L雌激素即可引發細胞中泌乳素的釋放，且雌二醇和己烯雌酚尚能夠激活胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)及與ERKs激活相關的通路[ER、表皮生長因子受體、膜組織化、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、Src激酶][18]。

2.2基因的異常表達 環境因素和遺傳因素共同導致腫瘤的發生，其中基因的異常表達與人類腫瘤的發生息息相關。在細胞的生長增殖中，原癌基因和抑癌基因的調控非常重要。

2.2.1與泌乳素腺瘤相關的原癌基因 癌基因活化使細胞發生數量或結構上的變化，導致細胞癌變，主要活化途徑有獲得啟動子與增強子、染色體異位、基因擴增和點突變。實驗證明，垂體瘤轉化基因 (pituitary tumor-transforming gene，PTTG)在大鼠正常垂體組織中不表達，但在雌激素成功誘導大鼠泌乳素腺瘤中高表達，并在體外培養的泌乳素腺瘤細胞中高表達，表明異常表達PTTG基因與泌乳素腺瘤的產生有較大的相關性[3]。并且，功能性人類泌乳素腺瘤也表達PTTG[19]，意味著人類泌乳素腺瘤中也存在特異性表達的原癌基因。

目前與PTTG基因相關的泌乳素腺瘤發生機制有以下推測：①PTTG與myc家族的c-myc癌基因啟動子結合后激活，從而使細胞無限增殖導致腫瘤的產生[18]；②PTTG基因可誘導成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)的分泌，FGF可促進腫瘤血管的形成，進而導致腫瘤發生[20-21]；③PTTG基因調控區發生點突變使其表達水平異常，從而導致細胞增殖等一系列變化[22-23]。

2.2.2與泌乳素腺瘤相關的抑癌基因 抑癌基因也稱為腫瘤抑制基因，這類基因發生突變、缺失或失活時會導致腫瘤的發生。Zhou等[24]研究表明，與垂體腫瘤有關的多種腫瘤抑制基因可基于它們與腫瘤抑制基因Rb或p53的相互作用而被分成p53組和Rb組；p53蛋白質是一種轉錄因子，由p53基因編碼形成，控制細胞周期的啟動，若其失活或突變，將引起細胞的不斷增殖而形成腫瘤，而p53組與泌乳素腺瘤相關的抑癌基因包括MEG3(maternally expressed 3)、6-氧-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶、多型性腺瘤基因樣蛋白1、Ras相關區域家族1基因、Ras相關區域家族3基因和細胞因子信號抑制分子1。Rb是視網膜母細胞瘤腫瘤抑制蛋白，由Rb基因編碼形成，Rb基因是人類克隆成功的第一個抗癌基因；Rb組與泌乳素腺瘤相關的抑癌基因包括細胞周期依賴性激酶抑制基因2A、細胞周期依賴性激酶抑制基因2B、細胞周期依賴性激酶抑制基因2C、視網膜母細胞瘤基因1、骨形態發生蛋白4、鈣黏蛋白1、鈣黏蛋白13、生長停滯和DNA損傷可誘導蛋白β、生長停滯和DNA損傷可誘導蛋白45g、芳烴受體相互作用蛋白和多發性內分泌腺瘤致病因子1(multiple endocrine neoplasia 1，MEN1)等[23]。其中p53組腫瘤抑制基因MEG3在垂體中發揮著重要的作用，Chunharojrith等[25]研究發現，p53的滅活完全消除了MEG3的腫瘤抑制，表明MEG3腫瘤抑制由p53介導。Rb組的MEN1基因也是一種與泌乳素腺瘤相關的腫瘤抑制基因，該基因編碼蛋白質menin，Walls等[26]研究表明，MEN1基因過表達在體外抑制了細胞增殖。

2.2.3垂體特異性轉錄因子1(pituitary specific transcription factor，Pit-1) Pit-1是垂體中轉錄因子 POU homeodomain家族成員，是3種垂體前葉細胞(即親軀體細胞、泌乳素細胞以及甲狀腺激素釋放激素細胞)正常生長所必需的，對生長激素(growth hormone，GH)、泌乳素、甲狀腺刺激素亞基的表達以及甲狀腺激素受體、GH釋放激素受體和 Pit-1自身表達均十分必要；實時熒光定量聚合酶鏈反應顯示，人泌乳素腺瘤中 Pit-1的表達增高[27]。大鼠Pit-1蛋白由273個氨基酸組成，包含N端轉錄激活區和POU區，N端轉錄激活區負責Pit-1蛋白對于靶基因的轉錄激活，POU區由POU特異區和POU源區組成，負責與靶基因的特異性結合；雌激素通過上調其受體和刺激Pit-1基因表達來增強泌乳素基因表達，誘發促性腺激素細胞轉化為泌乳素細胞，致大鼠泌乳素細胞中泌乳素表達增高以及高泌乳素血癥[28]。

在體內條件下，存在依賴雌激素的ER與Pit-1蛋白的物理結合，且這種相互作用在調控泌乳素基因表達中發揮著重要作用。在泌乳素垂體瘤細胞中，蛋白質合成抑制劑放線菌酮可阻斷復合物合成，減少雌激素激活的泌乳素基因表達，表明輔助蛋白因子參與了ER-Pit-1復合物形成及隨后的促泌乳素基因激活[29]。

2.3細胞因子調節 細胞因子被分為生長因子、炎癥因子、腫瘤壞死因子等。體內的這些細胞因子通過各種自分泌或旁分泌的方式發揮作用，對人體生理功能產生重要的調節作用。研究發現，與泌乳素腺瘤相關的生長因子有很多，FGF與血管生成相關，其中FGF-2及FGF-4均在泌乳素陽性垂體腺瘤中被發現；血管內皮生長因子在侵襲性泌乳素腺瘤中高水平表達，可能與腫瘤新生血管有關[19]。PTTG可以促進FGF和血管內皮生長因子的表達而誘導腫瘤血管的形成[20]。骨形態發生蛋白4是轉化生長因子-β家族成員之一。研究表明，骨形態發生蛋白 4在雌激素誘發大鼠垂體泌乳素腺瘤及人類垂體泌乳素腺瘤中均過度表達，并可通過與ER的相互作用促進泌乳素分泌及泌乳素細胞增殖[30]。

2.4受體調控機制 多巴胺D2受體敲除的小鼠可形成泌乳素腺瘤，但具體的發病機制尚不明確[10]。多巴胺受體是含7個跨膜區域的G蛋白偶聯受體家族，可將胞外刺激轉導入細胞內。G蛋白的調節亞基Gαi可抑制腺苷酸環化酶，使環腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)產生減少，進而使蛋白激酶A減少，蛋白激酶A可催化cAMP應答元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)絲氨酸殘基磷酸化，從而激活Pit-1[31]。而Pit-1是GH和泌乳素表達所必需的轉錄因子，Pit-1的啟動子包括1個Pit-1結合位點和2個CREB結合位點[32-34]。因此，CREB磷酸化水平的改變可使GH和泌乳素基因的轉錄水平發生變化，進而導致泌乳素生成增加。

2.5細胞信號通路調控機制 目前與泌乳素腺瘤發生相關的信號通路包括：PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路或Ras/ERK信號通路的持續激活，能使敏感的細胞轉化為腫瘤細胞。有研究通過泌乳素腺瘤與正常垂體組織比較發現，垂體泌乳素腺瘤細胞中PI3K/Akt信號通路在最初的級聯反應中被上調，PI3K/Akt和Ras/ERK信號通路通過酪氨酸激酶受體被激活，導致細胞周期抑制蛋白失活，從而導致細胞過度增殖，而信號通路的異常和通路之間的相互作用可能在垂體泌乳素腺瘤發生的初始階段發揮重要作用[35]；Wnt/β聯蛋白(β-catenin)信號通路，氟維司群是一種ER拮抗劑，可通過Wnt/β-catenin信號通路抑制垂體瘤MMQ細胞的增殖和泌乳素的分泌[36]。

2.6miRNA的調控機制 miRNA是一類非編碼RNA，在轉錄后可調節大量基因的表達，在許多細胞過程中起著重要的作用。目前，在腫瘤的研究中對腫瘤所涉及的miRNA的研究十分重視，也取得了很多重大的進展。對垂體泌乳素腺瘤相關的miRNA的探索也取得了一定成就，它將作為一種新型的生物標志物用于疾病的檢測和治療。Bottoni等[37]發現，在泌乳素腺瘤中miR-15a和miR-16-1的表達顯著下調。之后，對于miRNA的研究逐漸深入，研究證實，垂體腺瘤中表達上調的miRNA有miR-23a、miR-107、miR-150、miR-152、miR-191、miR-192和miR-212[38]以及 miR-26a和miR-26b[39]；表達下調的主要有miR-23b、miR-130b、miR-34b、miR-570、miR-603、miR-128a、miR-132、miR-24、miR-98、miR-143、miR-145和let-7[34]。miRNA通過其特定的靶基因來調控機體的反應。目前對于miRNA具體調控哪些靶基因的表達雖有一定的基礎研究，但具體機制尚不明確，需繼續深入探索。

3 小 結

垂體泌乳素腺瘤對人類生殖健康產生了極大的危害，經過國內外學者多年的探索，垂體泌乳素腺瘤的研究取得了很多進展。目前垂體泌乳素腺瘤的動物模型制作方法均不夠完善。泌乳素腺瘤發病機制的研究已發展到細胞和分子水平，存在多種理論假說，但仍需進一步的研究來闡明其確切的發病機制。因此，急需研發出更精準的泌乳素腺瘤動物模型，深入開展泌乳素腺瘤發病機制的研究，為后期垂體泌乳素腺瘤的治療和臨床藥物研發提供依據。