基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定飼料中喹乙醇方法探究

袁艷茹

（安陽(yáng)市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心 455000）

喹乙醇又名喹酰胺醇、倍育諾、快育靈、奧拉多司等，屬于人工合成的喹喔啉二氧化物類藥物。 它對(duì)革蘭陰性菌如巴氏桿菌、大腸桿菌、單胞菌等作用較強(qiáng)，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌如金黃色葡萄球菌、鏈球菌、密螺旋體等也有一定的作用。 另外，它對(duì)其他抗生素如氯霉素、四環(huán)素等有耐藥性的細(xì)菌作用敏感。 喹乙醇被作為促生長(zhǎng)劑，因其具有促進(jìn)蛋白同化，提高飼料轉(zhuǎn)化率，不但能使豬增重加快，還能提高瘦肉率[1]。 因喹乙醇的廣譜抗菌效果，促進(jìn)生長(zhǎng)，提高瘦肉率，曾經(jīng)被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)中。 但大量研究表明喹乙醇有很多毒害作用：隨著喹乙醇劑量增加，可對(duì)動(dòng)物的肝臟腎臟造成嚴(yán)重器質(zhì)性損害[2]；也可對(duì)動(dòng)物的免疫器官造成損害及對(duì)紅細(xì)胞免疫功能產(chǎn)生抑制[3]；還可誘導(dǎo)動(dòng)物生精細(xì)胞的凋亡[4]；近年來(lái)， 飼料生產(chǎn)過(guò)程非法添加和養(yǎng)殖過(guò)程中違規(guī)使用喹乙醇現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，有關(guān)喹乙醇使動(dòng)物中毒報(bào)道時(shí)有出現(xiàn)，這就需要加強(qiáng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管，從源頭控制濫用及違法使用喹乙醇。由于喹乙醇多方面的危害， 國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2018 年發(fā)布了2638 號(hào)公告停止喹乙醇使用于食品動(dòng)物。雖然發(fā)布了禁用公告，而對(duì)養(yǎng)殖過(guò)程中飼料中喹乙醇監(jiān)測(cè)不能停， 從而杜絕非法使用喹乙醇行為。 目前飼料中喹乙醇測(cè)定方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[5]、高效液相色譜法[6]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]。 酶聯(lián)免疫吸附法具有前處理簡(jiǎn)單、 檢測(cè)速度快特點(diǎn)， 但易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性；高效液相色譜法靈敏度較低、檢出限高，背景高，判定檢出限附近低含量樣品較為困難； 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高靈敏度、高選擇性、低檢出限，定性可靠、定量準(zhǔn)確特點(diǎn)。 本文超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定飼料中喹乙醇也具有上面液質(zhì)法特點(diǎn)，此外具有更高分離度，更快分析速度。 本文就是基于這種技術(shù)對(duì)飼料中喹乙醇檢測(cè)原理，前處理過(guò)程、分析測(cè)定過(guò)程及結(jié)果計(jì)算就行了探究。

1 原理的探究

1.1 喹乙醇的性質(zhì)

一般物質(zhì)結(jié)構(gòu)決定物質(zhì)性質(zhì)。 喹乙醇有一個(gè)醇羥基，一個(gè)酰胺基，一個(gè)喹喔啉二氧化物結(jié)構(gòu)，三種結(jié)構(gòu)都是極性基團(tuán)，易與水形成氫鍵，可在水中溶解。

通過(guò)分析喹乙醇結(jié)構(gòu)我們來(lái)總結(jié)喹乙醇性質(zhì)：淡黃色結(jié)晶粉末，無(wú)臭苦味。 它溶于熱水，微溶于冷水，幾乎不溶于甲醇、乙醇、氯仿等一般有機(jī)溶劑。 熔點(diǎn)209℃左右（分解），常溫下性質(zhì)穩(wěn)定，易于保存，在40℃可保存3 年。 它對(duì)光敏感，光照分解為棕色或深棕色物質(zhì)[8]。

1.2 固相萃取

固相萃?。⊿olid Phase Extraction）簡(jiǎn)稱SPE，是基于液固色譜理論，采取選擇性吸附、選擇性洗脫，從而對(duì)樣品中目標(biāo)組分進(jìn)行分離、凈化、富集的一個(gè)過(guò)程。 HLB SPE 柱為本文方法采用的樣品分離、凈化和富集SPE 柱，這種SPE 柱不存在傳統(tǒng)反相硅膠鍵合柱存在的問(wèn)題。 這種SPE 柱為親水親脂平衡共聚物SPE柱，它既有親水基團(tuán)，使填料具有水可浸潤(rùn)性，又有親脂基團(tuán)，使填料具有反相保留能力。 HLB SPE 柱比傳統(tǒng)反相SPE 柱有以下優(yōu)勢(shì)：平衡上樣時(shí)即使干涸對(duì)回收率和重復(fù)性無(wú)影響；pH 應(yīng)用范圍廣為1～14；吸附劑親水結(jié)構(gòu)（極性結(jié)構(gòu)）有助于保留親水性物質(zhì)；填料無(wú)硅醇基結(jié)構(gòu)，不會(huì)吸附堿性物質(zhì)，比表面積也很大，用料比傳統(tǒng)硅膠吸附劑少很多。

HLB SPE 柱可以去除樣品中基質(zhì)干擾、分離富集目標(biāo)組分、增強(qiáng)儀器性能、增強(qiáng)分析信號(hào)、降低噪音、簡(jiǎn)化工作流程，特別對(duì)于液相色譜質(zhì)譜這種高靈敏度儀器， 減少基質(zhì)干擾和富集組分至關(guān)重要。

1.3 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定飼料中喹乙醇原理

采用甲酸乙腈溶液在40℃超聲提取飼料中喹乙醇，經(jīng)HLB SPE 柱分離凈化后，經(jīng)60℃氮吹濃縮，在用乙腈溶液溶解，之后上超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品，外標(biāo)法定量。

甲酸乙腈溶液為極性有機(jī)水溶液既可沉淀蛋白又可以提取極性有機(jī)物喹乙醇， 而喹乙醇在熱水中溶解， 所以40℃超聲提取。 喹乙醇結(jié)構(gòu)中既有親水基團(tuán)（極性基團(tuán)）又有親脂基團(tuán)（非極性基團(tuán)），用親水親脂聚合物HLB SPE 柱凈分離化正好。 喹乙醇受基質(zhì)影響較大，所以用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品，上超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定，既可以準(zhǔn)確定性，又可以外標(biāo)法準(zhǔn)確定量。

2 前處理過(guò)程探究

因喹乙醇對(duì)光敏感，整個(gè)前處理過(guò)程注意避光。

2.1 樣品提取過(guò)程探究

準(zhǔn)確稱取飼料樣品，相同質(zhì)量基質(zhì)匹配空白試樣，相同質(zhì)量基質(zhì)匹配空白試樣（作陽(yáng)性添加用），分別于50mL 聚丙烯離心管中，同時(shí)準(zhǔn)備一個(gè)空管作試劑空白。 空白樣品里加入一定量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液這就是陽(yáng)性添加樣品。 加入10mL 0.1%甲酸乙腈溶液，高速渦動(dòng)混勻1min，使提取液充分浸潤(rùn)飼料，為充分提取做準(zhǔn)備。40℃超聲提取10min，因喹乙醇在熱水中溶解，再加上超聲振動(dòng)，使提取更加充分。 9000r/min 離心15min，經(jīng)過(guò)離心，管中液固分離，目標(biāo)組分轉(zhuǎn)移到液體中，收集上清液即可。 殘?jiān)蒙厦嫱w積提取液重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，混勻，為總提取液。 提取一次能提取到目標(biāo)組分80%左右， 重復(fù)提取一次可達(dá)到完全提取。

準(zhǔn)確移取5mL 總提取液于試管中，60℃氮吹至2mL， 氮吹可以充分揮發(fā)掉樣液中乙腈， 樣液中60%乙腈不利于樣品凈化時(shí)目標(biāo)組分的保留。 之后加入4mL 0.1mol/L 磷酸二氫鉀溶液，目的是調(diào)節(jié)樣液pH 為下一步HLB SPE 柱凈化做準(zhǔn)備， 渦動(dòng)使殘余物充分溶解，為備用液。

2.2 樣品凈化過(guò)程探究

按照樣品數(shù)量取HLB SPE 柱，一次用3mL 甲醇活化，甲醇充分浸潤(rùn)吸附劑，進(jìn)入吸附劑孔內(nèi)并保留在吸附劑內(nèi)。 再用3mL水平衡， 為上含水樣品做準(zhǔn)備。 取所有樣品備用液分別過(guò)HLB SPE 柱， 目標(biāo)組分直接與吸附劑發(fā)生親水親脂作用而保留在吸附劑上。之后用0.02mol/L3mL 鹽酸淋洗，主要洗掉一些水溶性堿性雜質(zhì)，之后用3mL 5%甲醇淋洗，主要洗掉一些極性有機(jī)雜質(zhì)，淋洗完后擠干。 然后用5mL 純甲醇洗脫，收集洗脫液，主要將保留在吸附劑上目標(biāo)組分喹乙醇用純極性有機(jī)溶劑甲醇洗脫下來(lái)。 60℃氮吹至干，將溶劑甲醇揮發(fā)掉，只剩下目標(biāo)組分在試管中，這是濃縮目標(biāo)組分。 最后加入20%乙腈溶液高速渦旋充分溶解，為凈化液。 過(guò)0.22μm 濾膜，待上機(jī)測(cè)定。

2.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液制備過(guò)程探究

取合適濃度的乙腈喹乙醇適量，氮?dú)獯蹈桑?mL 基質(zhì)匹配空白樣品的凈化液溶解，配制成濃度為5、10、20、50、100ng/mL基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，過(guò)濾膜上機(jī)即可。 對(duì)于超出校準(zhǔn)曲線濃度范圍樣品，樣品凈化液用20%乙腈稀釋多少倍，一般基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和陽(yáng)性添加樣品凈化液也稀釋多少倍， 這樣用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)校準(zhǔn)樣品，重復(fù)性和回收率比較好。 由于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的儀器靈敏度很高，校準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)不宜超過(guò)100ng/mL。

3 分析測(cè)定過(guò)程的探究

3.1 色譜條件探究

色譜柱：BEH C18 柱，柱長(zhǎng)5cm，內(nèi)徑2.1mm，粒徑1.7μm，超高效液相色譜柱體現(xiàn)內(nèi)徑?。ㄆ胀ㄉV柱4.6mm）、粒徑小（普通色譜柱5μm）這樣分離度高，靈敏度高、分析速度快。

流動(dòng)相：A 為乙腈，B 為0.1%甲酸水溶液，模式為梯度洗脫程序，梯度洗脫程序?yàn)椋浩鹗紶顟B(tài)A 為6%、B 為94%；2.5 分鐘時(shí)候A 為15%、B 為85%；3.0 分鐘時(shí)候A 為100%、B 為0%；4.0 分鐘時(shí)候A 為100%、B 為0%；5 分鐘時(shí)候A 為6%、B 為94%。0.1%甲酸溶液有利于目標(biāo)組分離子化。

流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量：2μL。

3.2 質(zhì)譜條件探究

電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；毛細(xì)管電壓：3.0kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑溫度：500℃；脫溶劑氣流速：1000L/h； 錐孔氣流速：150L/h； 碰撞氣流速：0.15mL/min；定性、 定量離子對(duì)和錐孔電壓、 碰撞能量為264.16>143.10、36V、34eV；264.16>212.08、36V、24eV。

3.3 定性定量測(cè)定探究

3.3.1 定性測(cè)定探究

一種藥物一般選擇1 個(gè)母離子和2 個(gè)母離子的碎片特征子離子，相同實(shí)驗(yàn)條件下，色譜圖中待測(cè)物選定三個(gè)離子保留時(shí)間與這種藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)三個(gè)離子保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)， 而且待測(cè)物定性離子離子豐度比與濃度接近這種藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液定性離子離子豐度比比較，定性確證偏差按下面規(guī)定來(lái)，離子豐度比用k 表示，允許偏差用d 表示。當(dāng)k>50%，d 為±20%；當(dāng)50%≥k>20%，d 為±25%； 當(dāng)20%≥k>10%，d 為±30%； 當(dāng)k≤10%，d 為±50%。為當(dāng)則可判定樣品中存在這種待測(cè)藥物[7]。試劑空白和樣品空白色譜圖中不能出現(xiàn)和陽(yáng)性添加樣品相同定性定量離子對(duì)。 目標(biāo)藥物定性確證選擇三個(gè)離子和定性離子離子豐度比范圍都是參照歐盟2002/657/EC 指令（結(jié)果分析與方法性能要求），對(duì)LC/MS/MS 來(lái)說(shuō)，質(zhì)譜法確證有機(jī)化合物或污染物需要4 個(gè)IP 點(diǎn)對(duì)應(yīng)是1 個(gè)母離子和2 個(gè)母離子的碎片子離子。 定性離子離子豐度比一般指色譜圖中定性離子峰面積與定量離子峰面積之比。

3.3.2 定量測(cè)定探究

一般是在儀器最佳條件下，對(duì)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液、待測(cè)陽(yáng)性添加樣品溶液，待測(cè)樣品溶液進(jìn)樣，上機(jī)測(cè)定。 之后用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積和濃度去分別校準(zhǔn)待測(cè)陽(yáng)性添加樣品溶液和待測(cè)樣品溶液峰面積， 即可分別得出待測(cè)陽(yáng)性添加樣品溶液和待測(cè)樣品溶液的濃度。 外標(biāo)法單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)即可。

4 結(jié)果計(jì)算的探究

對(duì)于計(jì)算出陽(yáng)性結(jié)果， 核查待測(cè)樣品定性離子的離子豐度比是否在定性確證規(guī)定的范圍內(nèi)，用來(lái)確證是否為這種藥物；質(zhì)控陽(yáng)性添加樣品回收率也要在一定范圍內(nèi)， 主要用于反映分析人員的操作技術(shù)水平， 更重要的是它反應(yīng)了分析方法是否適合被測(cè)物質(zhì)，幫助分析人員及時(shí)地發(fā)現(xiàn)分析中存在的問(wèn)題，確保分析數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠；兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差不超過(guò)20%，考察測(cè)定結(jié)果精密度，精密度越好、準(zhǔn)確度才能越好。

5 結(jié)語(yǔ)

本文對(duì)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定飼料中喹乙醇進(jìn)行了原理， 前處理過(guò)程、 分析測(cè)定過(guò)程及結(jié)果計(jì)算進(jìn)行探究，通過(guò)對(duì)用這種方法測(cè)定飼料中喹乙醇研究，我們對(duì)這種方法檢測(cè)喹乙醇更加清晰明了。 對(duì)于從事這方面檢測(cè)工作者提供了一個(gè)參考。 這種方法更高選擇性、更高靈敏度、更低檢出限、更快分析速度、更高分離度、更準(zhǔn)確定性定量方法，必將成為以后喹乙醇檢測(cè)趨勢(shì)， 也為飼料中喹乙醇準(zhǔn)確快速定性定量提供了便利。