轉(zhuǎn)錄因子Sox2對視網(wǎng)膜發(fā)育和功能的影響及作用

沈雨濛，沈吟

(武漢大學人民醫(yī)院眼科中心，武漢 430060)

轉(zhuǎn)錄因子Sox2(sex determining region Y-box 2)由定位于第3號常染色體長臂26區(qū)3帶至27區(qū)(q26.3～q27)的Sox2基因編碼表達[1]，在哺乳動物體內(nèi)廣泛存在，功能涉及眼發(fā)育、性別決定、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等方面[2]。Sox2在胚胎發(fā)育和細胞分化的多個時期均有表達，對未分化的胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞等的再生能力及干細胞的多能性至關重要，可在胚胎發(fā)育最早期開始起作用[3-4]。除具有維持細胞發(fā)育及細胞干性功能外，Sox2還兼具影響新陳代謝、增殖、凋亡與化學抵抗、侵蝕、腫瘤的成瘤和細胞的遷移等作用。

有研究表明，Sox2缺乏會引起成年小鼠神經(jīng)退行性病變和神經(jīng)損傷[5]。人眼中由Sox2基因缺陷引起的眼部病變具有非常典型的特征，統(tǒng)稱為Sox2無眼球綜合征，其臨床表現(xiàn)除先天性小眼和無眼畸形外，還伴有先天性食管閉鎖、生殖系統(tǒng)異常、腦部發(fā)育異常、垂體發(fā)育不全等[6-7]。先天性小眼癥和無眼癥是一種少見的眼球發(fā)育缺陷，有資料顯示，先天性小眼癥的患病率約為3/10萬，先天性無眼癥為14/10萬[8]。Sox2是目前唯一明確的引起先天性小眼癥和無眼癥的單基因突變致病基因[8]。目前，對Sox2 無眼球綜合征的研究尚處于臨床病例收集和匯總階段，對其致病機制的研究非常有限[9-10]。全面認識Sox2對視網(wǎng)膜發(fā)育和功能的影響，有助于眼科醫(yī)師研究與其相關眼病的病理機制，為相關疾病的防治提供新思路。

1 Sox2基因敲除小鼠的視網(wǎng)膜表現(xiàn)

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞均由一組放射狀的神經(jīng)前體細胞(neural progenitor cells，NPCs)發(fā)育形成。Sox2是高遷移率族蛋白轉(zhuǎn)錄激活因子(屬于SoxB1亞家族)的一員，在發(fā)育中和成熟后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前體祖細胞干性的維持中發(fā)揮重要作用[11]。若Sox2功能在胚胎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中受到損傷和破壞，將導致NPCs和成熟神經(jīng)元數(shù)量的減少[12]。目前，關于Sox2維持NPCs干性的機制尚未闡明。

在脊椎動物中，視網(wǎng)膜中的六種神經(jīng)元細胞和一種神經(jīng)膠質(zhì)細胞均由視網(wǎng)膜前體細胞(retinal progenitor cells，RPCs)按照特定的時間順序發(fā)育形成[13]。為了確保視網(wǎng)膜中各種細胞發(fā)育成熟且細胞間比例正確，在整個視網(wǎng)膜發(fā)育過程中均需保證RPCs干性的維持與分化之間的平衡，這種平衡通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元細胞發(fā)育的各種轉(zhuǎn)錄因子的共同協(xié)調(diào)實現(xiàn)，如具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)和同源盒家族的轉(zhuǎn)錄因子[14]。

轉(zhuǎn)錄因子Sox2在視網(wǎng)膜發(fā)育的各階段均有表達。在新生小鼠視網(wǎng)膜中，Sox2在RPCs中大量表達，隨著視網(wǎng)膜發(fā)育成熟，在出生4～10 d小鼠視網(wǎng)膜中可見，隨著視網(wǎng)膜明顯分層的逐漸出現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Sox2的表達也逐漸定位于神經(jīng)節(jié)細胞層(ganglion cell layer，GCL)和內(nèi)核層(inner nuclear layer，INL)。在成年小鼠視網(wǎng)膜中，轉(zhuǎn)錄因子Sox2在GCL和INL穩(wěn)定表達，包括Müller細胞、無長突細胞以及Glial膠質(zhì)細胞[15]。

有研究表明，敲除Sox2轉(zhuǎn)基因成年小鼠出現(xiàn)視神經(jīng)變細、視交叉結(jié)構(gòu)紊亂等發(fā)育不良現(xiàn)象，并且神經(jīng)節(jié)細胞、水平細胞、無長突細胞、視桿雙極細胞、視桿光感受器細胞等各種類型細胞的數(shù)量顯著減少；僅敲除一條染色體的Sox2基因時，上述現(xiàn)象較敲除兩條染色體Sox2基因時減輕，說明轉(zhuǎn)錄因子Sox2對視網(wǎng)膜發(fā)育的影響與其表達量呈正相關；此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Sox2通過直接調(diào)控Notch1轉(zhuǎn)錄因子的表達影響視網(wǎng)膜的發(fā)育[16]。在Sox2突變小鼠中，Sox2的表達精確調(diào)節(jié)了RPCs的分化時間及其遷移位置[17]。在Sox2基因敲除小鼠中，NPCs異常分化且缺乏Sox2對Notch信號通路的激活，從而引起RPCs增殖減少，導致小眼癥[16]。另有研究表明，Sox2缺乏會引起成年小鼠神經(jīng)退行性病變和神經(jīng)損傷[5]。

2 轉(zhuǎn)錄因子對RPCs的影響

RPCs在分化發(fā)育為各神經(jīng)元細胞的過程中需保持多能干性。維持RPCs中Sox2和人配對盒基因6(paired box gene 6，Pax6)含量的比例對維持RPCs的多能干性至關重要[18]。在人類和小鼠的眼中，轉(zhuǎn)錄因子Pax6突變或過表達導致眼部表型異常，出現(xiàn)小眼癥、無眼癥、白內(nèi)障和無虹膜眼[19-23]。條件性敲除小鼠RPCs的Pax6將導致除γ-氨基丁酸能無長突細胞外的所有類型視網(wǎng)膜細胞數(shù)量的減少；同時，Pax6在虹膜和睫狀體上皮中也高度表達，對于RPCs的發(fā)育和分化起重要作用[24-25]。視網(wǎng)膜Sox2水平自視網(wǎng)膜中央向邊緣逐漸降低，而視網(wǎng)膜中Pax6水平與Sox2的分布相反，自視網(wǎng)膜中央向邊緣逐漸升高[26]。有研究表明，抑制RPCs中Sox2活性時，RPCs中與神經(jīng)元發(fā)育相關轉(zhuǎn)錄因子(如Notch1)的表達急劇減少，導致RPCs神經(jīng)干性喪失，同時Pax6以及睫狀上皮(非神經(jīng)元)標志物的表達水平升高，使本該發(fā)育為神經(jīng)元的細胞向睫狀體非神經(jīng)元上皮發(fā)育和分化[16,26]。因此，轉(zhuǎn)錄因子Sox2的正確表達是維持RPCs神經(jīng)干性不可或缺的因素，其缺失或表達減少均將引起RPCs異常分化，導致視網(wǎng)膜發(fā)育異常。

3 轉(zhuǎn)錄因子Sox2對視網(wǎng)膜Müller細胞發(fā)育的影響

3.1Müller細胞的發(fā)育過程 在脊椎動物出生后，視網(wǎng)膜中的RPCs主要分化為視桿光感受器細胞、雙極細胞和Müller細胞[14]，其中Müller細胞是唯一同時保持RPCs形態(tài)和類似基因的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞[8,22,27]。Müller細胞是脊椎動物視網(wǎng)膜中的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，其上端達外界膜，下端達內(nèi)界膜，貫穿視網(wǎng)膜全層。Müller細胞作為視網(wǎng)膜的支持細胞，對視網(wǎng)膜的神經(jīng)保護、營養(yǎng)、代謝等起重要作用；同時，Müller細胞作為脊椎動物視網(wǎng)膜的基礎膠質(zhì)細胞，是一種生理狀態(tài)下的靜止前體細胞，在生理穩(wěn)態(tài)條件下，Müller細胞具有維持視網(wǎng)膜正常結(jié)構(gòu)和提供神經(jīng)元營養(yǎng)支持的功能。Müller細胞表達大量的前體細胞相關的轉(zhuǎn)錄因子，但仍保存前體細胞的形態(tài)，在視網(wǎng)膜出現(xiàn)損傷時被激活，可在一定程度上修復視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能。研究表明，Müller細胞的NPCs功能具有可逆性，當視網(wǎng)膜受到損傷后，它們可以重新進入細胞周期，并具有分化產(chǎn)生神經(jīng)元的潛力[28]。因此，Müller細胞被認為是視網(wǎng)膜中潛在的NPCs，也是國內(nèi)外視網(wǎng)膜損傷治療關注的關鍵靶點之一。當視網(wǎng)膜受到損傷后，Müller細胞將重新進入細胞分裂周期[29]，這一過程涉及多種調(diào)控胚胎發(fā)育的信號通路，其中Notch信號通路非常關鍵，不僅調(diào)控了NPCs的功能，還調(diào)控了膠質(zhì)細胞的再生[30]。發(fā)狀分裂相關增強子1/5是Notch通路下游的調(diào)控因子，不僅是出生后視網(wǎng)膜發(fā)育過程中Müller細胞的重要標志物，還在確定Müller細胞身份方面發(fā)揮至關重要的作用[31]。發(fā)狀分裂相關增強子1通過其持續(xù)的非振蕩表達調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞的靜止狀態(tài)，并可以防止細胞在靜止狀態(tài)下進入不可逆轉(zhuǎn)的分化周期[32]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過程中，Notch1是Sox2的直接轉(zhuǎn)錄目標[26]。在Sox2蛋白敲除新生小鼠視網(wǎng)膜中，Notch1和發(fā)狀分裂相關增強子5的表達減少，從而影響Müller細胞重新進入細胞分裂周期。

3.2Sox2對Müller細胞發(fā)育的具體影響 在新生小鼠視網(wǎng)膜中，Müller細胞需要轉(zhuǎn)錄因子Sox2來阻止其最終的有絲分裂。在小鼠視網(wǎng)膜Müller細胞中，條件性敲除轉(zhuǎn)錄因子Sox2的表達，將引起新生Müller細胞失去正常形態(tài)而呈放射狀或異常的細胞分裂狀態(tài)，其胞體原定位于網(wǎng)狀層，但敲除轉(zhuǎn)錄因子Sox2后，其胞體異常定位于核細胞層，并可能引起整個視網(wǎng)膜失去正常的結(jié)構(gòu)形態(tài)[15]。視網(wǎng)膜電圖結(jié)果顯示，條件性敲除小鼠視網(wǎng)膜Müller細胞中的轉(zhuǎn)錄因子Sox2，視網(wǎng)膜電圖b波的幅度較正常小鼠下降，說明敲除轉(zhuǎn)錄因子Sox2后的視網(wǎng)膜整體功能受到了影響[33]。Gorsuch等[34]的研究表明，當正常斑馬魚光損傷31 h后，其視網(wǎng)膜Müller細胞大量增殖；利用嗎啉代使斑馬魚視網(wǎng)膜Müller細胞中Sox2表達減少后，Müller細胞的增殖大大減少，而重新在Müller細胞中過表達Sox2后，Müller細胞的增殖又增多，可見轉(zhuǎn)錄因子Sox2是視網(wǎng)膜Müller細胞增殖和發(fā)育過程中必不可少的重要轉(zhuǎn)錄因子。

4 轉(zhuǎn)錄因子Sox2對視網(wǎng)膜無長突細胞發(fā)育的影響

4.1無長突細胞的分類和發(fā)育過程 無長突細胞是視網(wǎng)膜中的中間神經(jīng)元，其樹突分叉延伸至內(nèi)叢狀層，與神經(jīng)節(jié)細胞和(或)雙極細胞連接形成突觸，負責輸出雙極細胞的信息，特異性很高。根據(jù)樹突形態(tài)和層級分類可至少將無長突細胞分為33種不同的亞型，各型無長突細胞通過釋放一種或多種神經(jīng)遞質(zhì)與其他視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞相聯(lián)系。根據(jù)無長突細胞釋放的神經(jīng)遞質(zhì)的種類可以分為γ-氨基丁酸能、甘氨酸能或其他類型無長突細胞。γ-氨基丁酸能無長突細胞通常細胞胞體較大，主要分布在視網(wǎng)膜GCL和INL，目前對星形無長突細胞(一種γ-氨基丁酸能無長突細胞)的研究較多，星形無長突細胞以釋放膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶為特征，被認為參與調(diào)控了視覺的方向選擇和方向性活動，故稱為膽堿能無長突細胞；星形無長突細胞呈顯著的星形放射形態(tài)，在視網(wǎng)膜GCL和INL成簇分布[35]，且單個星形無長突細胞的樹突很少相互交叉，形成特征性“星爆”形態(tài)[36]，故又稱星爆無長突細胞(starburst amacrine cell，SBACs)，但相鄰細胞間的樹突狀高度重疊[37]，并形成相互抑制性突觸[38]。膽堿能無長突細胞是最易辨認的視網(wǎng)膜無長突細胞，也是視網(wǎng)膜中唯一的膽堿能神經(jīng)元[39]。根據(jù)膽堿能無長突細胞的胞體分布及其樹突位置(INL的ON層和OFF層)分為ON型(GCL)和OFF型(INL)[40]，雖然膽堿能無長突細胞的數(shù)量僅占無長突細胞總數(shù)的5%，占整個視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞總數(shù)的0.5%，但具有顯著的細胞形態(tài)和分布特征，是目前研究最多、最深入的無長突細胞[41-42]。

4.2Sox2對無長突細胞發(fā)育的影響 哺乳動物胚胎形成后10 d至出生后4 d，無長突細胞由視網(wǎng)膜神經(jīng)生發(fā)層分化[43]，無長突細胞發(fā)育早期，膽堿能無長突細胞在視網(wǎng)膜內(nèi)層呈單層分布[44]，隨后逐漸分化為ON型和OFF型兩種不同膽堿能無長突細胞[45]。在膽堿能無長突細胞遷移至視網(wǎng)膜內(nèi)部定位于INL和GCL并分為兩個單獨的細胞層之前，條件性敲除膽堿能無長突細胞中的Sox2基因，將導致INL和GCL中膽堿能無長突細胞數(shù)量的變化，導致INL中的膽堿能無長突細胞數(shù)目增多，而GCL中的膽堿能無長突細胞數(shù)目減少，但兩層膽堿能無長突細胞的總數(shù)未發(fā)生變化；此外，膽堿能無長突細胞的細胞表型也發(fā)生了變化，條件性敲除無長突細胞中Sox2基因后，GCL中的大部分膽堿能無長突細胞的樹突呈雙向分布，而位于INL的膽堿能無長突細胞失去了正常膽堿能無長突細胞應有的嘌呤受體2表達[46]。在條件性敲除Sox2的視網(wǎng)膜中，膽堿能無長突細胞的整個樹突分布區(qū)域面積并無變化[47]，且細胞未出現(xiàn)更多的樹突間交叉[48]。Sox2通過誘導Pax6、神經(jīng)源性分化蛋白D啟動子誘導RPCs分化為無長突細胞[49]。

5 轉(zhuǎn)錄因子Sox2對視網(wǎng)膜雙極細胞發(fā)育的影響

5.1視網(wǎng)膜雙極細胞的發(fā)育過程 在小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育過程中，雙極細胞的發(fā)育和分化主要發(fā)生在出生后，在出生后第3天達到高峰[50]。雙極細胞是視網(wǎng)膜的第二級神經(jīng)元，與其上級的光感受器細胞和下級的神經(jīng)節(jié)細胞相連接，將從光感受器細胞接收的信號傳遞給神經(jīng)節(jié)細胞，且雙極細胞還通過旁突觸縫隙連接與無長突細胞和水平細胞相連接[51]。根據(jù)功能可將雙極細胞可分為視錐雙極細胞和視桿雙極細胞，雙極細胞的突觸輸入來自桿或錐光感受器細胞，由此可將雙極細胞分為視桿雙極細胞或視錐雙極細胞[52]，視錐雙極細胞有10種類型，而視桿雙極細胞只有1種類型；根據(jù)軸突位置又可將雙極細胞分為OFF型和ON型，其中近3/4的雙極細胞為ON型[53]。在小鼠視網(wǎng)膜中，ON型雙極細胞包括視錐和視桿兩種雙極細胞類型，OFF型雙極細胞僅包含視錐雙極細胞[54]。

5.2Sox2對雙極細胞發(fā)育的影響 ON型和OFF型雙極細胞通常分別與ON型和OFF型的 SBACs建立突觸連接。雙極細胞表面表達不同的鈣黏素，是雙極細胞與其他細胞進行突觸連接的特異識別位點[55]。有研究發(fā)現(xiàn)，在條件性敲除Sox2的小鼠視網(wǎng)膜中，位于GCL的ON型SBACs可接收來自ON型和OFF型雙極細胞的興奮性信號；與正常小鼠相比，Sox2敲除小鼠ON型和OFF型SBACs動作電位的振幅減少，反應時間縮短，說明Sox2敲除小鼠視網(wǎng)膜中SBACs與雙極細胞間的突觸連接異常[56]。

6 小 結(jié)

Sox2是哺乳動物胚胎發(fā)育過程中必需的轉(zhuǎn)錄因子，具有維持細胞多能性和干性的功能，可促使已分化的細胞重新進入分裂周期[57]；此外，Sox2對器官發(fā)育至關重要，如眼的正常發(fā)育，Sox2基因突變會導致小眼癥、無眼癥和其他眼部營養(yǎng)不良[58]，并影響視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜中各類細胞(如Müller細胞、無長突細胞及雙極細胞)的發(fā)育。Sox2是目前唯一明確的單基因突變引起先天性小眼球和無眼球的致病基因。如何有效治療眼遺傳性疾病一直是眼科醫(yī)師的努力目標，目前治療眼遺傳性疾病的主要方法有干細胞療法、基因治療、人工視網(wǎng)膜等，利用Sox2轉(zhuǎn)錄因子對眼部發(fā)育的促進作用及其維持RPCs干性的特性，可在基因水平利用基因編輯技術治療視網(wǎng)膜遺傳性疾病。充分了解Sox2對視網(wǎng)膜發(fā)育和功能的影響及機制，將為視網(wǎng)膜遺傳病、視網(wǎng)膜發(fā)育不良等疾病的研究和治療提供新方向。