嵌合抗原受體T細(xì)胞治療胰腺導(dǎo)管腺癌的研究進(jìn)展

李精華，張革紅

(1.山西醫(yī)科大學(xué)研究生院，太原 030000； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤科，太原 030000)

胰腺癌是一種病死率很高的惡性腫瘤[1]，其發(fā)病率不斷上升，預(yù)計到2030年會成為美國和歐洲第二大癌癥死亡原因[2]。在胰腺癌中，胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)出現(xiàn)的概率超過90%，但5年生存率低于8%[3]。PDAC對放、化療和靶向治療等均不敏感，且還存在多種免疫抵抗機(jī)制，如改變遺傳和表觀遺傳、復(fù)雜且密集的腫瘤微環(huán)境以及腫瘤微環(huán)境中存在不同類型的免疫細(xì)胞等，而這些免疫細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展及復(fù)發(fā)，同時與腫瘤治療過程中耐藥性的出現(xiàn)存在密切聯(lián)系[4]。目前，惡性腫瘤免疫治療主要包括免疫檢查點抑制劑、嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T細(xì)胞)、主動免疫和被動免疫等，CAR-T細(xì)胞療法作為腫瘤免疫治療中的重要方式之一，在血液系統(tǒng)腫瘤的治療中實現(xiàn)了一定突破。近年來，隨著腫瘤靶點的不斷發(fā)現(xiàn)，CAR-T細(xì)胞療法成為實體腫瘤新的治療手段。CAR-T細(xì)胞可以識別腫瘤的特異性抗原，防止自身出現(xiàn)免疫耐受介導(dǎo)的現(xiàn)象，發(fā)生免疫逃逸[5]，CAR-T細(xì)胞的這一優(yōu)良特性顯示了其治療實體腫瘤的巨大前景?，F(xiàn)就CAR-T細(xì)胞治療PDAC的研究進(jìn)展予以綜述。

1 CAR-T細(xì)胞概述

1.1CAR-T細(xì)胞的作用機(jī)制 CAR-T細(xì)胞是一種通過基因工程來表達(dá)針對某種特定抗原嵌合受體的T細(xì)胞，利用非組織相容性復(fù)合體限制的方法與腫瘤抗原特異性結(jié)合，啟動活化增殖后，特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞。CAR作為T細(xì)胞受體中的嵌合分子，由抗原識別域和胞內(nèi)信號域組成，其中抗原識別域由單克隆抗體的單鏈可變區(qū)片段(single-chain variable fragment，scFv)構(gòu)成，多肽或其他蛋白質(zhì)也可作為其組成部分，能夠?qū)μ禺愋缘哪[瘤抗原進(jìn)行識別，而胞內(nèi)信號會刺激T細(xì)胞活化并增殖，利用細(xì)胞溶解和細(xì)胞因子釋放等對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行消除[6]。

1.2CAR-T細(xì)胞的分類和發(fā)展 根據(jù)細(xì)胞內(nèi)的信號結(jié)構(gòu)區(qū)域CAR可分為三代，第一代CAR只包括細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(scFv)和細(xì)胞內(nèi)CD3ζ信號鏈；第二代CAR具有來自CD28或4-1BB分子的獨特的共刺激結(jié)構(gòu)域，通過提高改良T淋巴細(xì)胞的存活率，提高臨床療效[7]；第三代CAR由具有3個或更多細(xì)胞共刺激結(jié)構(gòu)域的分子組成，除了CD28和4-1BB(CD137)外，CD27、可誘導(dǎo)共刺激分子或OX40也可能被耦合，這在理論上增加了基因工程T淋巴細(xì)胞的激活、存活和效力[8]。CAR-T細(xì)胞療法目前已發(fā)展至第四代，其中二代CAR-T細(xì)胞治療血液系統(tǒng)腫瘤的成就最引人矚目。2017年，美國食品藥品管理局批準(zhǔn)了兩種CAR-T細(xì)胞藥物，即用于治療兒童和年輕成年患者急性淋巴細(xì)胞白血病的Kymriah以及用于治療復(fù)發(fā)性、難治性大B細(xì)胞淋巴瘤成人患者的Yescarta，應(yīng)用這兩種藥物治療的總體緩解率均能達(dá)80%以上[9]，但這種療法目前尚未在國內(nèi)獲批，仍需大量臨床試驗證明其療效及安全性。目前，關(guān)于實體腫瘤(如卵巢癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤以及肝癌)，CAR-T細(xì)胞療法在動物模型和臨床試驗中均已顯現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果。

2 CAR-T細(xì)胞作用于PDAC的相關(guān)靶點

CAR-T細(xì)胞療法針對的是腫瘤的特異性抗原，特異性越高，其有效性和安全性越高。CAR定向的理想靶抗原應(yīng)是只在癌細(xì)胞中高表達(dá)的腫瘤特異性抗原，但目前發(fā)現(xiàn)的抗原基本屬于腫瘤相關(guān)抗原，而且腫瘤相關(guān)抗原在正常組織中存在不同程度的表達(dá)，此類抗原與CAR-T細(xì)胞結(jié)合后會攻擊正常組織，導(dǎo)致組織損傷，甚至?xí)霈F(xiàn)免疫缺陷的現(xiàn)象[10]。因此，尋找與PDAC相關(guān)的具有較高敏感性和特異性的抗原，增強(qiáng)惡性腫瘤治療的靶向性，可以防止正常組織損傷，減少治療過程中出現(xiàn)的不良反應(yīng)。

2.1間皮素 間皮素是一種細(xì)胞表面的糖蛋白，其因在正常間皮細(xì)胞中的低表達(dá)和在廣譜實體腫瘤中的高表達(dá)而成為腫瘤免疫治療的一個重要靶點[11]。免疫組織化學(xué)和基因表達(dá)分析顯示，基本上所有的胰腺癌組織和細(xì)胞系中均有間皮素表達(dá)，但在正常的胰腺組織中一般沒有表達(dá)[12]。雖然間皮素在胰腺癌進(jìn)展中的確切作用目前尚不明確，但對胰腺癌組織的前期研究表明，間皮素可能在推動胰腺癌細(xì)胞增殖、延緩細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[13]。已有相關(guān)研究進(jìn)行動物模型實驗，為靶向間皮素的CAR-T細(xì)胞在胰腺癌治療中的潛在臨床應(yīng)用提供了依據(jù)和經(jīng)驗，如He等[14]發(fā)現(xiàn)，靶向間皮素的CAR-T細(xì)胞可顯著抑制腫瘤生長，并能夠產(chǎn)生高水平的γ干擾素；此外，腫瘤緩解后更多靶向間皮素的CAR-T細(xì)胞分化為記憶性T細(xì)胞，對主要器官損傷較小。2015年，治療胰腺癌的首個CAR-T細(xì)胞藥物CARTmeso問世，研究者們用CARTmeso對6例化療難治性轉(zhuǎn)移性PDAC患者進(jìn)行了Ⅰ期臨床研究，以評價CAR-T細(xì)胞療法的安全性和有效性，結(jié)果顯示4例患者發(fā)生了疾病進(jìn)展，2例患者疾病穩(wěn)定，6例患者均未發(fā)生細(xì)胞因子釋放綜合征或神經(jīng)癥狀的不良反應(yīng)，同時不存在劑量限制的毒性[15]。這表明，針對胰腺癌的CARTmeso治療具有可行性和安全性，但其抗腫瘤活性時間短暫，可能會出現(xiàn)疾病進(jìn)展，因此需要聯(lián)合治療來加強(qiáng)CARTmeso的有效性和延長持續(xù)時間。目前，二代CARTmeso正在研究中，可能會更進(jìn)一步優(yōu)化CARTmeso的療效。

2.2癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA) CEA也屬于一種腫瘤相關(guān)抗原，CEA在胰腺癌中表達(dá)的陽性率超過70%，是CAR-T細(xì)胞治療PDAC的理想靶點[16]。臨床前試驗結(jié)果證明，CEA-CAR-T細(xì)胞對腫瘤的生長具有顯著的抑制作用，同時發(fā)現(xiàn)重組人白細(xì)胞介素-12能夠在體內(nèi)提高CEA-CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性，促進(jìn)CEA-CAR-T細(xì)胞的增殖，表明CEA是治療PDAC的一個很有前途的靶點，聯(lián)合應(yīng)用CEA-CAR-T細(xì)胞和重組人白細(xì)胞介素-12可以克服單純應(yīng)用抗癌藥物的局限性，為實體腫瘤的治療提供新策略[17]。但也有報道顯示，靶向CEA的CAR-T細(xì)胞治療后，有患者出現(xiàn)明顯的呼吸系統(tǒng)不良反應(yīng)，原因可能為肺上皮細(xì)胞表達(dá)CEA，而CAR-T細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子γ干擾素同時也會上調(diào)細(xì)支氣管上皮細(xì)胞，使其表達(dá)更多的CEA，加重不良反應(yīng)，因此在使用靶向CEA的CAR-T細(xì)胞治療時要謹(jǐn)慎衡量，防止出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)[18]。

2.3前列腺干細(xì)胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA) PSCA是由人體自然產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)編碼基因，在60%～80%的PDAC中高表達(dá)，第一例PSCA-CAR-T細(xì)胞是基于人源化的7F5 scFv的第一代CAR，對PSCA陽性的膀胱癌細(xì)胞具有有效的體外細(xì)胞溶解活性[19]。有學(xué)者對第三代PSCA-CAR-T細(xì)胞(包含OX40和CD28共刺激結(jié)構(gòu)域)用于治療表達(dá)PSCA的黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行了研究[20]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)共刺激信號域可以決定CAR對腫瘤抗原表達(dá)的敏感性，與含有CD28共刺激信號域的PSCA-CAR相比，PSCA-CAR中的4-1BB細(xì)胞共刺激信號域提高了對腫瘤抗原密度的選擇性，減少了T細(xì)胞耗竭表型，并具有同等的腫瘤殺傷能力[21]。

2.4黏蛋白1 (mucin 1，MUC1) MUC1屬于一種在上皮細(xì)胞根尖表面表達(dá)的跨膜糖蛋白，被國家癌癥研究所確認(rèn)為第二大靶向抗原[22]。異常腫瘤相關(guān)MUC1(tumor-associated mucin 1,tMUC1)在80%的人PDAC中表達(dá)[23]，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子；tMUC1高表達(dá)發(fā)生在疾病的早期，與PDAC患者的預(yù)后不良有關(guān)[24]。臨床前實驗結(jié)果表明，胰腺癌細(xì)胞表面過度表達(dá)一種突變的Tn-MUCl抗原，用5E5-CAR-T細(xì)胞特異性識別Tn-MUCl治療PDAC荷瘤小鼠，能使小鼠的惡性腫瘤大部分消退，生存時間增加，且存活率超過60%[25]。研究還發(fā)現(xiàn)，利用單克隆抗體TAB 004的可變片段研制的新型CAR-T細(xì)胞可在PDAC細(xì)胞上與tMUC1特異性結(jié)合，具有較強(qiáng)的殺傷活性，但并不結(jié)合或殺死正常的上皮細(xì)胞，進(jìn)一步證明tMUC1-CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)能夠抑制胰腺原位腫瘤的生長[26]。但是，眾所周知PDAC對包括免疫治療在內(nèi)的多種治療方法存在耐藥性[27]。因此，發(fā)現(xiàn)PDAC對tMUC1-CAR-T細(xì)胞治療不敏感以及耐藥后并不奇怪，對與免疫耐受相關(guān)基因進(jìn)行的實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析顯示，吲哚胺2，3-雙加氧酶-1、環(huán)加氧酶1/2以及半乳糖凝集素-9在耐藥的PDAC細(xì)胞中均過度表達(dá)，表明CAR-T細(xì)胞與吲哚胺2，3-雙加氧酶、環(huán)加氧酶1/2、半乳糖凝集素-9等生物抑制劑的結(jié)合可顯著增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞對PDAC細(xì)胞的殺傷作用[26，28]?；谝陨涎芯?，MUC1可以作為治療胰腺導(dǎo)管腺癌的一個很有希望的CAR-T細(xì)胞的靶點。

2.5人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2) HER2屬于一種跨膜糖蛋白，在發(fā)育中的胚胎和成體組織中能夠介導(dǎo)細(xì)胞的增殖和分化[29]。HER2可對細(xì)胞凋亡進(jìn)行抑制，誘導(dǎo)新生血管形成，增強(qiáng)細(xì)胞運動能力，從而促進(jìn)腫瘤的快速生長增殖和浸潤轉(zhuǎn)移[30]。HER2在正常組織(尿道、胃腸道、呼吸道等組織)中的表達(dá)水平不同，在7%～58%的胰腺癌組織中能夠檢測到HER2過表達(dá)[31]，因此HER2可作為胰腺癌CAR-T細(xì)胞治療的特異性靶點。目前針對HER2-CAR-T細(xì)胞治療的Ⅰ期臨床試驗已完成，評價了治療晚期胰腺癌的可行性和安全性，試驗中11例患者使用白蛋白結(jié)合型紫杉醇和環(huán)磷酰胺進(jìn)行預(yù)處理后，接受1～2周期HER2-CAR-T細(xì)胞灌注，其中1例患者獲得4.5個月的部分緩解，5例患者疾病穩(wěn)定，且HER2-CAR-T細(xì)胞輸注后相關(guān)的不良事件均為輕、中度；輸注后的毒性反應(yīng)包括：1例患者在CAR-T細(xì)胞-HER2細(xì)胞灌注11 d后出現(xiàn)了可逆的嚴(yán)重上消化道出血，2例患者出現(xiàn)1～2級遲發(fā)性發(fā)熱，同時伴有C反應(yīng)蛋白和白細(xì)胞介素-6釋放[32]。因此，CAR-T細(xì)胞-HER2可作為治療晚期胰腺癌的特異性靶點，但需注意相關(guān)毒性反應(yīng)。

2.6成纖維活化蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP) FAP作為一種跨膜絲氨酸蛋白酶，高度表達(dá)于胰腺癌外基質(zhì)中的一個抗原表位，F(xiàn)AP-CAR-T細(xì)胞的主要作用機(jī)制之一為增強(qiáng)內(nèi)源性CD8受體T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)[33]。目前，針對胰腺癌的CAR-T細(xì)胞研究已完成臨床前試驗。研究證明，F(xiàn)AP-CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤基質(zhì)破壞能夠促進(jìn)藥物的傳遞，抑制腫瘤的進(jìn)展，且與單獨治療相比，聯(lián)合吉西他濱化療具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性；同時研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AP-CAR-T細(xì)胞能夠?qū)⒁恍┠[瘤外基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行清除，以達(dá)到抑制胰腺腫瘤生長的目的[34]。FAP-CAR-T細(xì)胞療法有望聯(lián)合放、化療和免疫檢查點抑制劑，提高胰腺癌治療的有效率。

2.7自然殺傷細(xì)胞2族成員D配體(natural killer group 2 member D ligand，NKG2DL) 目前已經(jīng)鑒定出兩個NKG2DL家族，包括主要組織相容性復(fù)合體 Ⅰ 類鏈相關(guān)蛋白A/B和UL16結(jié)合蛋白(UL16-binding protein，ULBP)[35]。NKG2DL在正常細(xì)胞中一般不表達(dá)或表達(dá)極少，但當(dāng)細(xì)胞受到感染或發(fā)生癌變時，NKG2DL的表達(dá)量會大幅上升，許多不同組織來源的腫瘤細(xì)胞系和原發(fā)腫瘤均表達(dá)NKG2DL，提示NKG2DL可能是實體腫瘤和血液病的治療靶點，其中主要組織相容性復(fù)合體 Ⅰ 類鏈相關(guān)蛋白A/B在胰腺癌的表達(dá)中占68%～89.3%[36]。針對胰腺癌的自然殺傷細(xì)胞受體(natural killer cell receptor,NKR)-2 CAR-T細(xì)胞治療已經(jīng)完成了臨床前試驗，結(jié)果表明，NKR-2 CAR-T細(xì)胞能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，且NKR-2 CAR-T細(xì)胞療法在治療急性髓細(xì)胞性白血病和多發(fā)性骨髓瘤者的 Ⅰ 期臨床試驗中表現(xiàn)出良好的安全性和耐受性，目前NKR-2 CAR-T細(xì)胞療法治療胰腺癌的 Ⅰ 期臨床試驗正在進(jìn)行[35]。

3 CAR-T治療PDAC存在的挑戰(zhàn)

雖然CAR-T細(xì)胞免疫療療法在過去幾年取得了臨床上的成功，但這種治療方法仍存在諸多挑戰(zhàn)。CAR-T細(xì)胞治療常見的挑戰(zhàn)有細(xì)胞因子釋放綜合征、脫靶效應(yīng)、非腫瘤效應(yīng)、腫瘤免疫微環(huán)境的抑制以及CAR-T細(xì)胞插入的突變等，其中最致命的為細(xì)胞因子釋放綜合征，這是因為大量的CAR-T細(xì)胞被激活后導(dǎo)致細(xì)胞因子過度分泌，嚴(yán)重者可引起急性呼吸窘迫綜合征和多器官衰竭等危及生命。但在目前的臨床實踐中，細(xì)胞因子釋放綜合征在血液腫瘤的CAR-T細(xì)胞治療中更為常見，研究發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞免疫療法在治療實體腫瘤的過程中，可通過聯(lián)合使用大劑量糖皮質(zhì)激素、血管升壓素和白細(xì)胞介素-6受體抗體進(jìn)行治療來預(yù)防細(xì)胞因子釋放綜合征以及其他不良反應(yīng)[37]。此外研究表明，在CAR-T細(xì)胞治療前，采用清除T細(xì)胞的方法對機(jī)體進(jìn)行預(yù)處理可顯著減少不良反應(yīng)[38]。

有報道顯示，患者的T細(xì)胞質(zhì)量會影響CAR-T細(xì)胞療法的成敗，其成功的關(guān)鍵為T細(xì)胞的擴(kuò)增能力，多數(shù)患者在接受CAR-T細(xì)胞療法時已接受了多個周期細(xì)胞毒藥物的治療，已經(jīng)造成了記憶性T細(xì)胞和天然T細(xì)胞的大量損失，特別是在經(jīng)過多次化療后CD27/CD28表達(dá)丟失的淋巴瘤患者中尤為顯著，胰腺癌患者也面臨同樣狀況[39]。由于CAR-T細(xì)胞目前尚不是治療實體腫瘤的一線療法，因此，多次化療后機(jī)體內(nèi)環(huán)境的變化也應(yīng)作為影響因素，在使用CAR-T細(xì)胞治療前予以考慮。

4 小 結(jié)

CAR-T細(xì)胞療法屬于新興腫瘤免疫治療，在治療血液腫瘤及非血液系統(tǒng)腫瘤中均取得了一定突破。目前已經(jīng)存在的研究成果為未來的胰腺癌研究提供了相關(guān)的治療經(jīng)驗及參考。今后的研究方向仍集中于開發(fā)新的特異性靶點、攻克腫瘤微環(huán)境以及減少脫靶效應(yīng)，同時構(gòu)建基于免疫治療的聯(lián)合治療方案，通過與傳統(tǒng)化放療、分子靶向治療、免疫檢查點抑制劑、生物抑制劑、腫瘤疫苗等有效聯(lián)合，發(fā)揮更好的臨床效用。另外，增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，發(fā)現(xiàn)更多的特異性腫瘤抗原，可以為未來CAR-T細(xì)胞治療PDAC提供更多依據(jù)。