腺相關病毒在視覺系統神經示蹤及眼科治療中的應用進展

蔡丹瑞，沈吟,2

(1.武漢大學人民醫院眼科中心，武漢430060； 2.武漢大學醫學研究院，武漢430071)

由于腦神經網絡的神經元種類數目繁雜且突觸連接復雜，人們對中樞神經系統的研究較為困難。視網膜和中樞神經系統在胚胎發育過程中均是由神經管發育而來，視網膜可視為活體個體中樞神經系統的一部分，因此視網膜不僅可作為視覺系統的首站處理系統，其結構功能的變化在一定程度上也可作為評估中樞神經系統持續變化的窗口[1]。為了進一步探究神經系統的發育、成熟以及疾病的病理改變，視覺及其他神經環路結構的清晰構建必不可少。為實現神經環路的示蹤，科學家們嘗試了多種示蹤方法，包括電鏡、Golgi鍍銀法以及熒光染料法(如熒光金、固藍、核黃)等[2]，但這些方法局限性較強，有方向不特異、不能跨突觸或跨突觸后信號衰減顯著等缺點，不能滿足人們對示蹤工具的需求。近年來，以病毒為載體的環路示蹤、基因編輯、基因治療等技術由于靶向性高、組織親嗜性好等原因逐漸走進人們的視野[3]。腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)因其獨有的優勢在逆轉錄病毒、腺病毒、狂犬病毒等病毒載體中脫穎而出，得到廣泛研究和應用。現就AAV在視覺系統神經示蹤、遺傳性疾病的損傷修復以及眼科相關基因治療中的應用進展予以綜述。

1 AAV概述

1.1AAV的血清型 AAV是無包膜的單鏈線狀DNA復制缺陷型病毒，需要在輔助病毒(如腺病毒、單純皰疹病毒)存在的條件下才能復制增殖。目前發現來自人的AAV血清型有12種，來自非人靈長類的AAV有100多種，不同血清型的AAV由于衣殼蛋白不同，對不同組織的感染效率不同[4]。在眼科中常用的AAV血清型至少有9種，不同血清型AAV由于衣殼蛋白不同，對視網膜不同細胞的趨向性也有所不同，其中AAV1、AAV2、AAV5型易感染視網膜色素上皮細胞；AAV2、AAV5、AAV2/7、AAV2/8型易感染光感受器細胞；AAV2/9型易感染Müller細胞；AAV2、重組AAV(recombinant AAV,rAAV)2/2、rAAV2/6型易感染視網膜神經節細胞[5-6]。AAV2型是目前發現最早、使用最多、研究最清楚的AAV，但仍存在對許多組織、細胞的感染效率不高等缺點，促使人們在視覺系統神經環路示蹤中嘗試運用不同血清型感染。有研究者在視網膜下注射AAV2和AAV5導致視網膜色素上皮細胞和光感受器細胞的轉導，而注射AAV4和AAV1只會導致視網膜色素上皮細胞的轉染[7-8]。玻璃體腔注射AAV2可導致高效的神經節細胞轉導，注射AAV8和AAV9可以侵染各層細胞，而注射AAV1、AAV4和AAV5無法檢測到表達[9]。

1.2AAV的應用優勢 與傳統示蹤劑相比，AAV具有顯著優勢。首先，作為病毒載體AAV具有能轉染細胞組織并復制擴散病毒的天然屬性；其次，與其他嗜神經病毒相比，AAV具有宿主范圍廣、無致病性、低免疫性、轉染和表達效率高且時間長以及分裂期或非分裂期的細胞均能被感染等優良特性，在實際應用中科研工作者們可根據不同的需求對AAV進行包括安全性、載體容量、轉染效率以及免疫反應等方面的改造[10-11]，以更好地滿足實驗或臨床需求。AAV作為一種安全性高、使用范圍廣的病毒載體廣泛應用于神經環路示蹤和基因治療等方面，不僅可通過攜帶熒光蛋白等特殊元件標識出視網膜結構網絡和視覺系統神經環路，還在治療某些遺傳性眼科疾病及外傷性視神經損傷中取得了顯著成效[12-13]。

2 AAV對視覺系統神經環路的標記

視網膜光感受器細胞是視覺傳導通路的起點，在接受光刺激后將光信號轉換成電信號，經中間神經元雙極細胞整合編碼后傳遞至神經節細胞，然后以動作電位的形式將視覺信息依次經軸突-視神經(顱神經Ⅱ)-視交叉-視神經束-外側膝狀體，再經視放射投射到大腦距狀溝周圍的枕葉皮質(視覺中樞)[14]，這是視覺信息經整合編碼、神經傳導、中樞投射，最終形成視覺圖像的整個通路，其中任何一個環節的病變均可導致視覺功能障礙。因此，深入研究視覺傳導通路中各個環節的突觸連接狀態至關重要，而完整清晰地標記這一通路是整個研究的基礎。

Stieger等[15]分別給大鼠和狗的視網膜下注射AAV2/8-綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，結果在視網膜色素上皮細胞層、光感受器細胞、內核層細胞以及神經節細胞層均可見GFP表達，表明AAV8對視網膜各層細胞的轉染效率均較好；進一步觀察神經節細胞的中樞投射情況發現，注射病毒2個月后的大鼠，在視神經、視交叉、視交叉上核、視束、腹外側膝狀核、背外側膝狀核、上丘等視覺通路中均可見強的GFP信號，但在視覺通路外未檢測到GFP信號。Delwig等[16]通過在Opn4-Cre小鼠的玻璃體腔中注射AAV-flex-plap病毒，特異性標記小鼠眼中的內在光敏感性視網膜神經節細胞并確定其投射的網絡，結果發現，其投射的大腦核團包括基底前腦、下丘腦、杏仁核以及丘腦和中腦的多個核團，光敏感性視網膜神經節細胞能夠表達黑視蛋白并與調節生理節律的視交叉上核存在密切的神經投射關系，主要對機體的晝夜節律、周期節律、情緒以及行為進行調控。AAV的長期穩定表達、低免疫性以及可攜帶多種標簽等優點，加上某些血清型的高感染效率，使得AAV在不跨突觸的示蹤病毒中具有顯著優勢，可結合cre-loxp系統對視覺系統中某些特殊類型的細胞及其投射和功能進行探究。

3 AAV與常間回文重復序列叢集/常間回文重復序列叢集關聯蛋白系統相結合對視網膜細胞進行基因組修飾

3.1常間回文重復序列叢集/常間回文重復序列叢集關聯蛋白(clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas)系統的工作原理 不同血清型的AAV在視覺系統環路示蹤中的應用具有顯著優勢，可以清楚地觀察到細胞在環路中的功能。近年來，將AAV與CRISPR/Cas基因編輯技術相結合成為眼科基因治療研究的新靶點。CRISPR/Cas系統是一種原核生物的免疫系統，用來抵抗外源遺傳物質的入侵，可以識別出外源DNA，并切割沉默外源基因的表達，與真核生物中RNA干擾的原理相似，正是由于這種精確的靶向功能，CRISPR/Cas系統被開發成一種高效的基因編輯工具[17]。在自然界中，CRISPR/Cas系統擁有多種類別，其中CRISPR/Cas9系統是研究最深入、應用最成熟的一種。目前已報道的3種將基因轉移進視網膜的方法中，AAV載體是將CRISPR組分遞送至視網膜最理想有效的基因轉移工具[18]。

3.2AAV載體在CRISPR/Cas系統中的應用 目前將CRISPR/Cas系統有效遞送到體內的方式主要有3種，即流體動力注射法、脂質體納米顆粒法和病毒載體轉染法，在病毒遞送系統中rAAV由于血清特異性高和免疫反應低成為使用最廣泛的系統[19-20]。Hung等[18]為了評估AAV2裝載CRISPR/Cas用于體內視網膜細胞基因修飾的可行性，構建了裝載化膿性鏈球菌Cas9的AAV2載體以及另一種在紅色熒光蛋白存在下遞送針對黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)或LacZ基因(對照)的向導RNA，向Thy1-YFP品系小鼠眼內注射AAV2- Cas9后發現，視網膜中的YFP表達顯著減少。Yu等[21]在動物視網膜下腔注射攜帶pV-Cas9或pV-sgRNA-tdTomato的AAV，通過視網膜熒光染色鋪片、流式細胞學、目標DNA的高通量測序、視網膜電流圖(electroretinogram，ERG)、視動反應等多種技術進行檢測，證明AAV載體法是最有效的體內視網膜基因編輯途徑。利用AAV-CRISPR/Cas9進行體細胞基因編輯已成功應用于非人靈長類動物的視網膜基因改造，McCullough等[22]通過AAV遞送的CRISPR/Cas9特異性地敲除視網膜鳥苷酸環化酶-1基因在獼猴視網膜光感受器細胞中的表達，顯著改變了視網膜的功能和結構，成功顯示了使用AAV-CRISPR/Cas9在非人靈長類動物中進行體細胞基因編輯的能力。

遺傳性視網膜疾病(inherited retinal diseases，IRDs)是一組致病基因超過250個的臨床和遺傳異質性疾病，其中最常見的為視網膜色素變性，目前第一個基因補充療法已被批準用于常染色體隱性突變的IRDs[23]，但對于常染色體顯性突變的IRDs，基因補充治療并不適用。在這種情況下，由AAV作為病毒載體介導的CRISPR/Cas基因編輯技術成為了治療新方法，治療策略主要包括通過非同源末端鏈接沉默或刪除致病基因，CRISPR激活增強功能缺失的基因的表達，利用同源重組修正或引入正確基因替代突變的致病基因[24-25]。目前，CRISPR技術在眼科中的應用包括先天性白內障、先天性青光眼、先天性角膜營養不良等遺傳性眼病，未來其將為眼科遺傳性疾病的治療提供更多可能性。

4 AAV在視網膜相關遺傳性疾病基因治療中的應用

4.1基因治療在遺傳性眼病中的應用 遺傳性眼科疾病是目前主要威脅兒童和青少年的致盲性眼病，約占所有致盲因素的50%，在遺傳性眼科疾病中危害最大的為IRDs，目前全球IRDs致盲人數約1 700 萬[26]，其中常見的疾病包括視網膜色素變性(40%)、錐-桿細胞營養不良(10%)、Usher綜合征(10%)以及Leber先天性黑矇(Leber′s congenital amaurosis，LCA)(5%)等[27]。IRDs的危害主要包括疾病種類繁多、失明風險極大、有可能遺傳給下一代以及目前絕大多數通過傳統方法很難治愈。

隨著人類基因組的解鎖以及基因測序技術的飛速發展，人們對無法用藥物和手術等傳統治療手段治愈的由基因突變引起的遺傳性疾病開始嘗試用基因治療。基因治療通過病毒載體將調控基因導入體內，以補償或矯正缺陷基因的功能，達到治療遺傳性疾病的目的[28]。在眼科遺傳性疾病研究中，向眼部注入健康基因修復突變已成為先天性和退行性失明最具潛力的治療途徑[29]。與傳統療法相比，基因治療的優勢不僅是緩解病癥而是從根本上治愈疾病。AAV因低免疫原性、高安全性等優勢成為臨床最適用、最受關注的基因治療相關的病毒載體。

AAV載體轉染視網膜主要通過玻璃體腔注射和視網膜下腔注射兩種方式，其中玻璃體腔注射主要轉染神經節細胞和Müller細胞，視網膜下腔注射主要轉染視網膜色素上皮細胞和光感受器細胞[30]。目前在基因治療的應用中，AAV2和AAV5載體最為常用，AAV2具有親神經性、優先轉染神經元、能有效轉染視網膜神經節細胞、表達持久等優點，而AAV5主要轉染光感受器和視網膜色素上皮細胞[31]。

4.2AAV載體在視網膜色素變性中的應用 視網膜色素變性是IRDs中最常見的一類疾病，這是一組以進行性視網膜光感受器細胞及視網膜色素上皮細胞功能喪失為主要特征的遺傳性視網膜退行性病變，其病理過程為視桿細胞和視錐細胞的先后凋亡以及視網膜色素上皮細胞變性導致的夜盲、進行性視野缺損、眼底骨細胞樣色素沉著以及ERG波形振幅減弱[32]，遺傳方式主要有常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳和X連鎖隱性遺傳三種[33]。目前臨床上常用的包括營養神經在內的藥物的療效均十分有限，基因治療的日益成熟為視網膜色素變性的治愈提供了極大可能。目前基因治療視網膜色素變性主要采用AAV介導的基因替代療法，即將正常基因導入視網膜靶細胞，進而產生正常的視網膜基因表現型[34]。Wang等[35]在視網膜色素變性小鼠的免疫反應中發現，在視錐細胞變性過程中存在小膠質細胞的活化，于是通過視網膜下腔注射腺相關載體AAV8和編碼小膠質細胞調節信號的可溶性CX3C趨化因子配體，結果發現，注射AAV8-可溶性CX3C趨化因子配體后可顯著升高小鼠的視錐細胞存活率且不影響小膠質細胞的定位或炎癥細胞因子表達水平。由桿狀磷酸二酯酶6A(phosphodiesterase 6A，PDE6A)基因突變引起的43型視網膜色素變性始于視桿細胞的功能障礙，隨后是整個視網膜外核層的進行性退化；針對PDE6A基因補充治療方法，Sch?n等[36]開發了一種新的AAV用于人視紫紅質啟動子控制下表達人PDE6A基因的載體rAAV8-PDE6A，并分別在注射后1個月和6個月進行短程效果和長程效果的檢測；在體內，通過ERG評估生物功能以及光學相干斷層掃描觀察視網膜形態結構發現，生物功能和視網膜形態結構均有顯著改善；在體外，小鼠桿狀光感受器中PDE6A蛋白的表達總體穩定且高效，同時核外核層厚度和桿狀外段結構均得到較好的形態學保護。

4.3AAV載體在LCA中的應用 LCA呈常染色體隱性遺傳，是發病時間最早也是最嚴重的遺傳性視網膜病變，常于出生后1年內發病，因眼球震顫、固視困難、畏光、患兒自主按壓眼球等癥狀引起家人的注意而就診。眼底檢查早期多無異常，隨著病程的發展眼底可見椒鹽樣色素沉著、血管狹窄、骨細胞樣色素沉著、廣泛色素上皮細胞凋亡和脈絡膜收縮等，ERG表現為波幅低平甚至消失[37]。LCA是首個基因治療的遺傳性眼病，美國食品藥品管理局批準Luxturna用于治療LCA，其針對的是由RPE65這個基因位點突變導致的LCAⅡ型，約占LCA的6%[38]。在大量臨床前研究的基礎上，2007年美國和英國的研究人員啟動了LCA患者基因治療的臨床試驗，并于2008年報道了基因治療能挽救患者部分視覺功能的初步成果[39-41]。隨后出現了更多的臨床試驗，其中包括2012年Jacobson等[42]開展的對15例LCA青少年和成人進行的基因治療后3年的跟蹤隨訪。Luxturna 通過rAAV將正確的RPE65基因導入眼部，產生有功能的蛋白，恢復受損神經細胞的功能，從而恢復喪失的視力；Luxturna曾獲得美國食品藥品管理局頒發的孤兒藥資格與突破性療法認定[43]。

5 小 結

作為有希望長期在體應用的病毒載體，AAV在基因治療中的應用越來越廣泛，已從試驗階段走向臨床應用，但同時也存在一些潛在的問題，如基因沉默導致的治療失敗、患癌風險增加等。rAAV作為人類基因治療最有希望的載體，已用于許多臨床試驗，最能體現其力量和潛力的是基于野生型AAV血清型的3種基因治療產品，即Glybera(AAV1)、Luxturna(AAV2)和最近的Zolgensma(AAV9)。Luxturna的大多數報告顯示，Luxturna可能不能恢復正常視力，只有約一半的治療患者符合美國食品藥品管理局的最低限度改善閾值，且改善可能不會長期持續[43]。目前AAV載體的產生需要改進轉導效力、抗體逃避和細胞/組織特異性，以允許使用更低和更安全的載體劑量。