電針對震顫麻痹大鼠黑質神經細胞凋亡的影響

黃亮，趙宇輝，孫忠人，盛國濱，李曉寧，倪金霞，李雪巖，戴縉，王迪★

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱；2.深圳市龍華區中心醫院，深圳；3.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱；4.北京中醫藥大學東直門醫院，北京）

0 引言

震顫麻痹多見于老年人，隨著中國人口不斷地老齡化，震顫麻痹的發病率日益增長?；加姓痤澛楸缘睦夏耆酥饾u喪失行動力、生活自理能力，給家庭及社會帶來了負擔。震顫麻痹的病理改變主要表現在多巴胺神經元的變性、缺失。研究發現，震顫麻痹大鼠黑質神經元發生明顯凋亡現象[1]。本實驗研究在電鏡下觀察各組大鼠黑質及紋狀體的病理形態學改變，觀察了電針舞蹈震顫區對震顫麻痹大鼠黑質神經細胞凋亡的影響，旨在探究電針治療震顫麻痹的作用機制，為臨床應用電針治療震顫麻痹提供基礎實驗佐證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

100 只雄性成年SPF 級SD 大鼠，（250±20）g 體重。實驗動物由黑龍江中醫藥大學動物實驗管理中心提供。所有實驗用鼠常規適應性飼養1 周，自由飲食、飲水，實驗所有過程符合動物倫理實驗標準。

1.1.2 主要試劑與藥物

6- 羥基多巴胺（6-OHDA）（美國Sigma 公司）；阿樸嗎啡（APO）（美國Sigma 公司）；戊巴比妥鈉（德國Merck 公司）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司）；戊二醛（北京索萊寶科技有限公司）；TUNEL 檢測試劑盒（美國Sigma 公司）；蛋白酶K（美國Sigma 公司）；左旋多巴（上海福達制藥有限公司）。

1.1.3 主要儀器

腦立體定位儀（美國stoelting 公司）；德國LEICA 公司生產的EG1160 組織包埋機和RM2235 型切片機；日本奧林巴斯公司生產的CX41 奧林巴斯顯微鏡；日本JVC 公司的TK-C9201EC 型攝像頭；透射電子顯微鏡（日本）；KWD-808 Ⅱ型全能脈沖電療儀。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

利用行為學篩選造模成功的大鼠36 只，隨機分為模型組、電針組、左旋多巴藥物組3 組，每組12 只，并設立正常組及假手術組2 組，每組12 只大鼠。正常組給予常規飼養；假手術組僅手術，不注射6-OHDA；模型組造模完成后不給予治療；電針組給予電針治療；左旋多巴藥物組給予口服左旋多巴治療。

1.2.2 動物模型建立

采用右側偏側帕金森模型，造模前用0.3%戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉，待大鼠角膜反射消失后，將大鼠固定于立體定位儀上。在無菌環境中沿正中矢狀線切開大鼠顱頂部皮膚，剝離皮下組織及骨膜，暴露前囟、人字縫，按Pellegrino LJ[2]等編著的大鼠腦立體定位圖譜確定右側黑質兩注射點位坐標：第1 點為前囟后3.0mm，正中線右側2.5mm，硬腦膜腹側8.6mm；第2 點為前囟后2.4mm，正中線右側2.7mm，硬腦膜腹側8.6mm。以鼠顱骨鉆按上述坐標鉆直徑為5mm 的孔。用10μL 微量進樣器以1μL/min 速度向嘴側注射4μL 6-OHDA、向尾側注射3μL 6-OHDA，每次注射完成后留針10min，然后以1.0mm/min 的速度緩慢退針，再用明膠海綿填塞顱骨孔，對切開進行縫合。造模完成后2 周腹腔注射APO 誘發旋轉行為（向健側旋轉），注射10min 后開始記錄，共記錄30min，旋轉速度達到6 轉/min 視為模型制備成功[3]。

1.2.3 治療方法

電針組大鼠給予電針治療。在右側舞蹈震顫區上點與下點采用0.25mm×25mm 毫針進行針刺，連接KWD-808 Ⅱ型全能脈沖電療儀，電針波形選擇疏密波（頻率為1Hz），調節電流強度至頭部皮膚輕微顫動，每次治療30min，每日治療1 次，共治療20 天。左旋多巴藥物組給予左旋多巴1.0mg 灌胃給藥，每日治療1 次，共治療20 天。

1.2.4 標本制備

治療結束后用0.3%戊巴比妥鈉（10mL/kg）進行腹腔麻醉，灌注固定后，每組選取6 只大鼠取腦內黑質置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋備用；余大鼠取腦內黑質及紋狀體置于戊二醛中固定備用。

1.3 檢測指標

1.3.1 病理形態學

透射電鏡下觀察大鼠黑質、紋狀體組織結構變化。

1.3.2 TUNEL 檢測

利用TUNEL 檢測法觀察各組大鼠黑質神經細胞凋亡情況。具體操作：切片置于二甲苯溶液中5min×2 次；再水化處理；蛋白酶K 培育30min；PBS 沖洗5min×2 次；平衡緩沖液37℃保濕盒培育2h；PBS 沖洗5min×2 次；封閉；鏈霉親和素HRP 培育30min；PBS 沖洗5min×2 次；DAB 顯色，鏡檢。利用圖像分析軟件測定各組大鼠黑質陽性細胞數目的平均光密度。

1.4 統計學處理

統計分析處理采用SPSS 19.0 軟件進行，用均數±標準差表示所有數據，分析不同組采用單因素方差，采用t 檢驗組間比較，P＜0.05 有統計學差異。

2 結論

2.1 透射電鏡觀察結果

正常組、假手術組大鼠黑質及紋狀體神經細胞結構清晰，胞體飽滿，核仁明顯，胞質內可見粗內質網、線粒體等細胞器；模型組大鼠黑質及紋狀體神經細胞胞體皺縮，可見粗內質網擴張，溶酶體增多，線粒體腫脹；電針組、左旋多巴藥物組大鼠黑質及紋狀體神經細胞胞體略縮小，粗內質網輕度擴張，偶見線粒體結構被破壞。

2.2 各組大鼠黑質神經細胞凋亡情況

TUNEL 檢測中，凋亡細胞核染色呈棕黃色或棕褐色，正常細胞核為藍色。實驗結果顯示：與正常組、假手術組相比較，模型組、電針組、左旋多巴藥物組神經細胞凋亡數量明顯升高；與模型組相比較，電針組和左旋多巴藥物組神經細胞凋亡數量顯著下降，電針組和左旋多巴藥物組相比，無統計學差異。見表1。

表1 各組大鼠黑質神經細胞凋亡的平均光密度（IOD/AREA）

3 討論

中國人口老齡化不斷加重，致使震顫麻痹的發病率也在逐年上升。震顫麻痹不僅給患病者帶來了巨大的痛苦，也給患病者的家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。因此尋求一種簡便、有效的治療方法刻不容緩。祖國醫學歷史悠久，針灸在治療疾病方面有其獨有的優勢。針灸不僅臨床療效顯著，而且還具有操作簡便、毒副作用小等特點。電針治療更是在毫針針刺的基礎之上，通過施以微量的電流起到治療疾病的效果。研究表明，電針波形中的疏密波能夠促進血液循環，促進組織代謝，改善機體營養，抑制細胞凋亡。因此，本研究采用電針治療震顫麻痹，觀察電針對震顫麻痹大鼠腦組織的影響，探究電針治療震顫麻痹的作用機制。

目前，震顫麻痹的發病機制尚未完全明確。大量實驗研究表明，震顫麻痹與多巴胺能神經元凋亡密切相關[4]。細胞凋亡屬于機體的一種程序性死亡，這種死亡模式不僅受基因的支配，同時也因外界不良刺激而啟動。細胞凋亡可由自由基、炎性因子、脂質過氧化反應等外界刺激誘發進行，而震顫麻痹在發病過程中均會引起上述病理改變。本實驗研究發現，與正常組、假手術組相比較，模型組、電針組、左旋多巴藥物組神經細胞凋亡數量明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比較，電針組和左旋多巴藥物組神經細胞凋亡數量顯著下降（P＜0.05），說明電針能夠通過抑制細胞凋亡對震顫麻痹大鼠黑質神經元起保護作用，這可能是電針治療震顫麻痹的作用機制之一。且電針組與左旋多巴藥物組相比較，對上述二者的影響不具有統計學意義，說明電針治療與藥物治療的療效接近。且相比應用藥物治療，電針治療不存在耐藥性及毒性等問題。電針治療震顫麻痹不僅具有較好的臨床療效，更有動物實驗研究作為其臨床應用的佐證，具有良好的應用前景。