胖大海潤(rùn)喉丸治療大鼠口腔潰瘍的實(shí)驗(yàn)研究

喜鵬

（甘肅省定西市第二人民醫(yī)院，甘肅 定西）

0 引言

口腔潰瘍（recurrent oral ulcer，ROU）是口腔黏膜病中的常見病癥，發(fā)病率很高，其發(fā)病特點(diǎn)為在局部形成潰瘍后可繼發(fā)感染，造成潰瘍局部組織炎癥和壞死?？谇粷儾∫驈?fù)雜，可能是多種因素綜合作用的結(jié)果[1-2]，其確切的發(fā)病機(jī)制仍處于研究之中，目前尚無(wú)較好的治療方法，尤其是相關(guān)中醫(yī)藥防治研究尤為薄弱。本研究選用的胖大海潤(rùn)喉丸由胖大海、桔梗、木蝴蝶、菊花、馬勃5 味藥材組成，具有疏風(fēng)清熱、解毒利咽之功效。本研究通過(guò)觀察胖大海潤(rùn)喉丸對(duì)大鼠口腔潰瘍面積、炎癥因子IL-6、TNF-α 水平及α-SMA、FGF1 蛋白表達(dá)含量的研究，以期探討胖大海潤(rùn)喉丸在ROU 治療中可能的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6-8 周SPF 級(jí) SD 大鼠，50 只，體質(zhì)量 180～220g，雄性，購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)定西校區(qū)科研實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物培育中心，合格證號(hào)為 SCXK（甘）2008-0010。

1.2 藥品及試劑

胖大海潤(rùn)喉丸（甘藥制字，批號(hào) Z0401082）；IL-6 試劑盒（Peprotech 公司 ）；TNF-α 試劑盒（Peprotech 公司）；冰醋酸（索萊寶公司）；RIPA 美國(guó) Beyotime 公司 P0013C；蛋白酶抑制劑混合物 I AppliChem 公司 A77060001；

BCA 蛋白定量濃度測(cè)定試劑盒北京索萊寶公司YG0134；兔抗人α-SMA 多克隆抗體 Immunollay 公司YT0883；兔抗人FAP多克隆抗體Immunollay 公司YT0845；兔抗人 GAPDH 多克隆抗體 杭州賢至生物公司。

1.3 儀器

連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó) BIO-RAD 公司）；游標(biāo)卡尺（碧云天公司）；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；蛋白核酸凝膠電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng) 美國(guó) BIO-RAD 公司；電泳儀 （德國(guó)Eppendorf 公司）；凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó) UVP 公司 ；電子分析天平 日本 Shimadzu 公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

SD 大鼠50 只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型組，胖大海潤(rùn)喉丸10、30、90mg/kg 組（中劑量為臨床等效劑量），每組10 只。

2.2 大鼠口腔潰瘍模型的制備

參考文獻(xiàn)方法[3-4]并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法制備大鼠口腔潰瘍模型；將大鼠用10%水合氯醛（3mL/kg）ip 麻醉，于大鼠口腔左側(cè)頰部黏膜下注射10%醋酸，0.1mL/只，對(duì)照組注射等量的生理鹽水，24h 后可形成口腔潰瘍。

2.3 胖大海潤(rùn)喉丸對(duì)大鼠口腔潰瘍的治療作

造模成功后第2 天開始給藥，將胖大海潤(rùn)喉丸研磨成粉，給藥時(shí)將藥粉（每只大鼠劑量的1/4）均勻涂于潰瘍面上，剩余藥粉（每只大鼠劑量的3/4）以水溶解后給大鼠灌胃?？瞻讓?duì)照組給予等量生理鹽水處理，連續(xù)給藥12d。各組大鼠于末次測(cè)量后，處死一起測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

2.3.1 測(cè)量大鼠口腔潰瘍面積的影響

用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠給藥前及給藥后第4、8、12 天的口腔潰瘍的最大橫徑（d1）及最大縱徑（d2），計(jì)算瘍面積（潰瘍面積＝π×d1×d2×1/4，π 取值 3.14）。

2.3.2 ELISA 法測(cè)定血清中IL-6 及TNF-α 含量

取離心后血清，用 ELISA 法，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)患 者血 清 中 IL-6、TNF-α 的 含量( ng·L-1)。

2.3.3 Western blot 檢測(cè)潰瘍組織α-SMA、FGF1 蛋白的表達(dá)

提取各潰瘍組織蛋白并定量。各組取20 μg 蛋白上樣，經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，4℃分別與一抗α-SMA（1：1000）、FGF1（1：1000）及GAPDH（1：500）蛋白相結(jié)合，搖床過(guò)夜；次日分別與山羊抗兔辣根酶標(biāo)記的二抗（l：5000）結(jié)合反應(yīng)，ECL 發(fā)光顯色后，凝膠成像系統(tǒng)曝光檢測(cè)，并采用Quantity One 4.6.2 軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析，以GAPDH 作內(nèi)參，結(jié)果將目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH 條帶的比值作為參照。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠口腔潰瘍面積的影響

觀察各組大鼠口腔潰瘍面的大體形態(tài)，結(jié)果顯示無(wú)潰瘍出現(xiàn)。注射醋酸后可出現(xiàn)明顯的口腔潰瘍，肉眼觀察潰瘍面的黏膜呈凹陷性缺損，大致呈圓形，表面為黃白色，周圍充血水腫，說(shuō)明口腔潰瘍模型制備成功。

大鼠口腔潰瘍模型呈現(xiàn)一定自愈性，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，潰瘍面積逐漸減小。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)各組大鼠口腔潰瘍面積無(wú)顯著性差異；在給藥第 4、8、12 天，與模型組比較，高劑量清咽滴丸組大鼠口腔潰瘍面積均顯著減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1。

表1 清咽滴丸對(duì)大鼠口腔潰瘍面積的影響, n=10)

表1 清咽滴丸對(duì)大鼠口腔潰瘍面積的影響, n=10)

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，與模型組比較，#P＜0.05

組別 潰瘍面積給藥前 給藥第4 天 給藥第8 天 給藥第12 天空白對(duì)照組 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0模型組 28.8±6.4* 26.2±5.4* 16.1±3.2* 8.8±2.1*胖大海低劑量組 27.3±4.8*# 23.5± 3.5*# 14.7±4.3*# 8.0±1.7*胖大海中劑量組 27.2±4.2*# 22.4 ± 3.3*# 15.0±5.5*# 7.3±2.3*#胖大海高劑量組 28.1± 6.0* 14.6± 4.0*# 9.5±4.2*# 4.5±2.2*#

3.2 胖大海對(duì)大鼠血清中IL-6、TNF-α 水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠口腔潰瘍組織中IL-6、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明模型組大鼠出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。與模型組比較，中、高劑量胖大海潤(rùn)喉滴丸組大鼠口腔潰瘍組織中IL-6、TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見表2。

3.3 胖大海對(duì)大鼠口腔潰瘍部位組織中α-SMA、FGF1 水平的影響

結(jié)果顯示（圖11 和表6），與正常組比較，模型組α-SMA、FGF1 蛋白表達(dá)均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，各胖大海干預(yù)組α-SMA、FGF1 蛋白表達(dá)均升高，其中胖大海高劑量組升高最顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清及IL-6 及TNF-a 水平水平比較

表2 各組大鼠血清及IL-6 及TNF-a 水平水平比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，與模型組比較，#P＜0.05

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A：BMSCs 組；B: L-6 100ng/mL+50ng/mL 組;C:黃芪多糖干預(yù)

表3 胖大海對(duì)大鼠口腔潰瘍部位組織中α-SMA、FGF1 水平的影響

4 討論

口腔潰瘍俗稱“口瘡”，是一種常見的發(fā)生于口腔黏膜的潰瘍性損傷病癥，發(fā)作時(shí)疼痛劇烈，局部灼痛明顯，嚴(yán)重者還會(huì)影響飲食及語(yǔ)言交流。ROU 是口腔臨床常見多發(fā)病，占口腔潰瘍的90%以上，反復(fù)發(fā)作，給患者帶來(lái)極大困擾，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。近來(lái)中醫(yī)藥對(duì)ROU 的治療已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展。陳卓等[5]研究發(fā)現(xiàn)清咽滴丸（方中有胖大海、桔梗、梔子、薄荷）可通過(guò)抑制口腔潰瘍大鼠TNF-α 水平，減輕大鼠口腔潰瘍面積來(lái)加速大鼠口腔潰瘍的愈合。我院制備的胖大海潤(rùn)喉丸由胖大海、桔梗、木蝴蝶、菊花等加工提煉而成，胖大海，味甘，涼，性寒。能清肺化痰，利咽開音，潤(rùn)腸通便，為治療咽喉腫痛之要藥；桔梗，味辛、性平，宣肺，利咽，祛痰之功效，對(duì)口腔潰瘍有很好的療效；木蝴蝶，具有潤(rùn)肺利咽的作用；菊花，甘苦，性微寒，具有疏散風(fēng)熱、清肝明目、清熱解毒的作用。馬勃，其性味辛平，有清肺利咽，止血之功效。上述藥配伍配伍，活血通脈而化瘀，防止瘀血內(nèi)停，清血分實(shí)熱，散瘀血留滯；同時(shí)全方兼有清熱解毒，涼血斂瘡的功效，配伍具有清而不寒，散而不滯的特點(diǎn)，從而達(dá)到防治口腔潰瘍的效果。

眾所周知炎癥因子與復(fù)發(fā)性口腔潰病的發(fā)生發(fā)展預(yù)后呈相關(guān)性，患者無(wú)論是漬病組織還是外周血中，都檢測(cè)到炎性細(xì)胞因子有異常增高或降低的趨勢(shì)。細(xì)胞因子中TNF-a 及IL-6 均是具有多種生物活性的，由免疫細(xì)胞合成分泌的多肽類因子，它們能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理功能，在機(jī)體炎癥、免疫應(yīng)答、急性反應(yīng)中起著非常重要的調(diào)控作用。IL-6 作為一種多效促炎的細(xì)胞因子，由B 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、以及部分腫瘤細(xì)胞分泌而成，它參與炎癥以及免疫反應(yīng)的多功能炎性因子。IL-6 常通過(guò)各種途徑促進(jìn)與參與口腔潰瘍的發(fā)生發(fā)展[6]。Ambrosch A 等[7]認(rèn)為無(wú)論是否存在細(xì)菌傷口IL-6 的水平都可作為有用的評(píng)估饋痕性炎癥敏感性和特異性的血清學(xué)標(biāo)志物。還有人認(rèn)為雖然復(fù)發(fā)性口腔潰病的治療效果可以通過(guò)口腔淸痕數(shù)目，間隔時(shí)間和發(fā)生的頻率評(píng)估，也可以監(jiān)測(cè)血清IL-6 水平來(lái)評(píng)價(jià)藥物的治療效果[8]。TNF-a 主要由單核巨唆細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)包括自身在內(nèi)的多種細(xì)胞因子以及一些炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，損傷組織，繼而加重炎癥反應(yīng)[9]。張琳[10]等用雙抗體夾心法研究在復(fù)發(fā)性口腔淸蕩患者中TNF-a 的變化及臨床意義，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性口腔漬蕩患者血清中TNF-a 的含量可明顯增高，提示參與了其病理過(guò)程。姜軍松[11]等釆用結(jié)晶紫染色法探討腫瘤壞死因子與復(fù)發(fā)性口掩的關(guān)系，以細(xì)胞作為革細(xì)胞，對(duì)復(fù)發(fā)性口腔潰蕩活動(dòng)期與緩解期患者及口腔粘膜外傷患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌的水平進(jìn)行生物活性檢測(cè)，表明在致病機(jī)理方面占有重要地位。.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型大鼠口腔潰瘍部位組織中IL-6、TNF-α 水平顯著升高，中、高劑量胖大海潤(rùn)喉丸可使口腔黏膜組織中IL-6、TNF-α 水平明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從而表明胖大海潤(rùn)喉丸可以通過(guò)下調(diào)炎癥因子，減輕口腔潰瘍的程度、促進(jìn)潰瘍愈合。這與相關(guān)文獻(xiàn)[12]報(bào)道是相一致的。

近年來(lái)有關(guān)FGF1、α-SMA 蛋白的異常表達(dá)在口腔潰瘍發(fā)生、發(fā)展中的作用備受關(guān)注[13]。FGF1 是成纖維生長(zhǎng)因子家族的成員之一，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)[14-16]。α-SMA 是活化的成纖維細(xì)胞的蛋白標(biāo)志物，它表達(dá)的增高提示著成纖維細(xì)胞的活化增多[17-18]。Ya Qing Tan 等[19]認(rèn)為FGF1 促進(jìn)組織愈合與其誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞的增殖分化、促進(jìn)血管再生以及誘導(dǎo)更多的營(yíng)養(yǎng)素和氧運(yùn)送至損傷區(qū)域有關(guān)。Lee 等[20]研究發(fā)現(xiàn) Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在組織愈合上發(fā)揮重要作用，當(dāng) β-catenin 的表達(dá)下降時(shí)，會(huì)出現(xiàn) α-SMA 減少，組織愈合緩慢。 α-SMA 的表達(dá)還應(yīng)該受Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，與模型相比較，中、高劑量組胖大海潤(rùn)喉丸FGF1、α-SMA 的蛋白表達(dá)含量均明顯增高（P＜0.05）。表明胖大海潤(rùn)喉丸可能通過(guò)上調(diào)FGF1、α-SMA 蛋白含量，促進(jìn)潰瘍愈合期成纖維細(xì)胞大量活化增殖，參與潰瘍愈合。

綜上所述，胖大海潤(rùn)喉丸通過(guò)降低炎性因子水平，上調(diào)FGF1、α-SMA 蛋白含量，從而促進(jìn)了口腔潰瘍潰病臨床愈合，縮短病程，減少?gòu)?fù)發(fā)。顯示了胖大海潤(rùn)喉丸獨(dú)具的特色和優(yōu)勢(shì)，具有效果顯著、作用確切等特點(diǎn)，有良好的推廣應(yīng)用價(jià)值。