基于網絡藥理學探討牛膝對骨關節炎的作用機制

董海鵬，孟凱

（1.山東中醫藥大學碩士研究生，山東 濟南；2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南）

0 引言

骨關節炎（osteoarthritis，OA）中醫屬于學“筋痹”“痹證”等范疇，是一種常見的慢性關節疾病[1]，膝關節最為常見[2]。原發性骨關節炎的發病原因迄今尚未完全明確，一般認為是多種致病因素包括機械性和生物性因素的相互作用所致。其中年齡是主要高危因素，其他因素包括外傷、肥胖、遺傳、炎癥等。女性發病率較高，在絕經后明顯增加，且與關節軟骨中發現雌激素受體有關。骨質疏松因軟骨下骨小梁變薄變硬時，其承受壓力的能力下降，因此出現骨關節炎的幾率較高。

中藥牛膝屬多年生草本，根入藥。性味：苦、甘、酸，平。歸肝、腎經。具有逐瘀通經，補肝腎，強筋骨，利尿通淋，引血下行的功效。《神農本草經》牛膝味苦、酸。主寒，濕痿痹，四肢拘攣，膝痛不可屈伸，逐血氣傷。臨床上常用牛膝配伍杜仲、桑寄生等治療骨關節炎，并有一定功效[3-5]。牛膝具有多成分、多靶點的調節的作用。

1 材料與方法

1.1 牛膝化學成分及作用基因靶點、骨關節炎基因靶點信息獲取

采用中藥系統藥理學技術平臺（TCMSP）檢索牛膝的化學成分及靶點。根據口服生物利用度（OB）＞30% 和類藥性（DL）＞0.18，篩選牛膝中的活性成分及其相關作用基因靶點。通過Genecard、OMIN 數據庫，輸入關鍵詞“osteoarthritis”獲取與骨關節炎相關靶點。

1.2 網絡的構建

利用R 語言繪制將牛膝活性成分相關的靶點和疾病靶點進行匹配，獲得牛膝活性成的潛對骨關節炎有作用的靶點，即兩者共同基因即為牛膝-骨關節炎的關鍵靶點。采用Cytoscape 軟件（Version3.7.1）構建“疾病-藥物-活性成分-基因靶點”關系網絡圖。網絡圖中藍色節點代表疾病與藥物活性成分的關鍵基因靶點，網絡圖中草綠色節點是藥物活性成分，通過構建這一網絡圖探析牛膝對骨關節炎的作用機制。

1.3 關鍵靶點蛋白相關作用網絡的構建

利用STRING 數據庫平臺預測的蛋白相互作用關系。將牛膝-骨關節炎的關鍵基因靶點導入String 數據庫，研究物種為選擇為人類（Homo sapiens），獲得蛋白互作關系，并將結果以TSV 格式導出。

1.4 關鍵基因靶點本體（gene ontology,GO）

富集分析和基因相互作用（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路，分析利用Bioconductor 平臺和R 語言對獲得的基因進行GO 富集分析和KEGG 通路分析。首先在R 中進行安裝包的安裝，安裝包包括"colorspace"、"stringi"、"DOSE"、"clusterProfiler"、"pathview"導出GO 富集分析表格，并繪制dotplot 點圖。KEGG 通路富集分析的安裝語言同上，可導出KEGG 富集分析表格，KEGG 通路圖，并繪制dotplot 點圖。

2 結果

2.1 牛膝活性成分的通過

TCMSP 平臺數據庫檢索，且OB＞30% 和DL＞0.18，篩選得到牛膝潛在活性成分，見表1。

表1 牛膝中潛在活性成分

2.2 牛膝活性成分對骨關節炎的潛在作用靶點預測

通過TCMSP 平臺數據庫檢索，篩選活性成分對應的潛在作用靶點，去除無效和重復靶點后，得到牛膝潛在活性成分的作用靶點100 個。利用Genecard 數據庫、OMIM 數據庫平臺，檢索“osteoarthritis”，共得到骨關節炎疾病的潛在作用靶點2397 個。利用R 語言獲得共同基因靶點為63 個（表2）。

2.3 疾病-藥物-活性成分-基因靶點網絡構建與分析

牛膝與骨關節炎作用靶點相關的藥物的潛在活性成分有16個，為poriferasta-7，22E-dien-3beta-ol、28-norolean-17-en-3-ol、berberine、coptisine、wogonin、delta 7-stigmastenol、baicalein、epiberberine、beta-sitosterol、Inophyllum E、kaempferol、Spinasterol、Stigmasterol、palmatine、beta-daucosterol_qt、quercetin。活性成分、基因靶點導入 Cytoscape 軟件進行網絡構建及可視化（圖1）。結果表明， quercetin、kaempferol、wogonin 等連接度較高，以上成分是牛膝治療骨關節炎的重要成分。

2.4 基因靶點蛋白質相互作用網絡分析

將牛膝- 骨關節炎的63 個潛在的關鍵基因靶點導入String數據庫平臺，選擇物種為人類，獲取蛋白質相互作用關系并繪制蛋白關系網絡（圖2）。排除2 個游離的無相互作用蛋白，該網絡圖共包括63 個節點，578 個邊。其中綜合數值最高，評分＞0.99 的相互作用蛋白為IKBKB、CASP8、RELA、CASP9、CYP1A1、IKBKB、IGF2、VEGFA、BCL2、BIRC5、CASP3、CASP8、CAV1、VEGFA、CAV1，這些蛋白之間的相互作用在網絡中具有重要地位，這些基因靶點在牛膝對骨關節炎治療中具有重要意義。

2.5 基因靶點生物功能及通路分析

GO 富集分析結果顯示，牛膝的63 個潛在關鍵基因靶點的GO富集排名靠前的生物學功能主要為DNA 結合轉錄激活因子活性，RNA 聚合酶II 特異性（15 個靶點PGR、ESR1、AR、RELA、TP63、FOS、HIF1A、FOSL1、NR1I3、ELK1、MYC、NFE2L2、PARP1、RUNX2、IRF1），RNA 聚合酶II 近端啟動子序列特異性DNA 結合（14 個靶點PGR、ESR1、AR、PPARG、RELA、HIF1A、FOSL1、AHR、ESR2、ELK1、MYC、HSF1、RUNX2、IRF1），近端啟動子序列特異性DNA 結合（14 個靶點PGR、ESR1、AR、PPARG、RELA、HIF1A、FOSL1、AHR、ESR2、ELK1、MYC、HSF1、RUNX2、IRF1），蛋白質異二聚活性（13 個靶點PPARG、RELA、BCL2、MCL1、VEGFA、FOS、HIF1A、AHR、IKBKB、EGFR、ERBB2、CAV1、HSF1），核受體活性（7 個靶點PGR、ESR1、AR、PPARG、AHR、ESR2、NR1I3）轉錄因子活性（7 個靶點PGR、ESR1、AR、PPARG、AHR、ESR2、NR1I3）RNA 聚合酶II 轉錄因子結合（7 個靶點ESR1、AR、GSK3B、FOS、AHR、ELK1、NFE2L2）等（圖3），表明牛膝就可以通過參與調控多種生物學過程而發揮抗骨關節炎作用。

KEGG 通路富集分析顯示，牛膝的關鍵基因靶點主要富集的通路為卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染，人巨細胞病毒感染，乙型肝炎，細胞凋亡，流體剪切應力與動脈粥樣硬化，糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路，麻疹，前列腺癌，TNF 信號通路等。牛膝的活性成分分布于多個通路，可通過各通路協調發揮抗骨關節炎作用（圖4）。

3 討論

牛膝是臨床治療骨關節炎的常用中藥，其提取物具有保護軟骨細胞作用[6,7]。牛膝總皂苷能有效抑制OA 滑膜炎癥，改善關節粘連度，降低滑膜組織β-catenin 蛋白表達以及減少關節液TNF-1，IL-1β，MMP-3 因子含量[8]。牛膝總皂苷含藥關節液能有效提高細胞活力、促進軟骨細胞增殖、提高Ⅱ型膠原蛋白表達，且降低軟骨細胞早期、晚期凋亡率[9]。牛膝醇提物能有效刺激軟骨細胞增殖，修復軟骨損傷，降低軟骨[10]。本研究旨在對牛膝治療骨關節炎的分子機制作初步探討，為臨床治療提供依據。研究表明牛膝與骨關節炎的相關成分16 個，共同作用靶點63 個，主要通過調控PGR、PPARG、PTGS1、AR、BCL2、CASP3、ESR1 等靶基因，通過卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染，人巨細胞病毒感染，乙型肝炎，細胞凋亡，流體剪切應力與動脈粥樣硬化，糖尿病并發癥中的AGERAGE 信號通路，麻疹，前列腺癌，TNF 信號通路等調節。研究表明，其中活性成分黃連素（coptisine）對骨關節炎關節軟骨基質降解因子MMP-13 及ADAMTS-5 的表達有抑制作用，對骨關節炎軟骨結構具有一定的改善作用[11]。槲皮素（quercetin）能夠顯著促進IL-1β 體外誘導兔軟骨細胞的增殖[12]，可顯著降低MMP-13/TIMP-1 的比例，促進抑制軟骨細胞外基質的降解[13]，促進對關節軟骨的保護。綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法，對牛膝藥治療骨關節炎的作用機制進行初步探討，結果表明了牛膝的主要潛在活性成分及作用靶基因與骨關節炎作用通路的關系，為進一步深入探討其作用機制提供了新思路。

表2 骨關節炎-牛膝基因靶點

圖1 疾病-藥物-活性成分-基因靶點網絡圖

圖2 牛膝治療骨關節炎相關基因的蛋白質相互作用網絡

圖3 牛膝活性成分治療骨關節炎基因靶點的GO 生物學過程富集分析

圖4 牛膝活性成分治療骨關節炎基因靶點的KEGG 代謝通路富集分析