白虎湯配方顆粒單煎與合煎成分研究

李養(yǎng)學(xué)，鐘惠嫻，李素梅，曾志浩，黃華靖

1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510095；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405

白虎湯原為陽明經(jīng)證的主方，后為治療氣分熱盛的代表方，由石膏30 g、知母9 g、甘草3 g、粳米6 g 組成，主治陽明氣分熱盛證，后來由于疾病種類的增加，推動其臨床應(yīng)用的發(fā)展，在內(nèi)、外、婦、兒科疾病中均有應(yīng)用［1］。中藥配方顆粒是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，采用現(xiàn)代科技手段將傳統(tǒng)中藥飲片按一定的生產(chǎn)工藝制成的提取物與適當(dāng)?shù)妮o料或藥材細(xì)粉制成的供臨床調(diào)劑使用的粉狀或顆粒狀產(chǎn)品［2-4］。礦物藥作為中國醫(yī)學(xué)臨床用藥的三大來源（植物藥、動物藥、礦物藥）之一，種類繁多，有著廣闊的研究前景［5-8］。近年來，中藥配方顆粒復(fù)方單煎、合煎在化學(xué)成分、藥效以及臨床療效對比研究已有相關(guān)報道，但含礦物類中藥配方顆粒復(fù)方單煎、合煎在化學(xué)成分方面的差異性尚未見研究。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用超高效液相（UPLC）及電感耦合等離子體-質(zhì)譜（ICP-MS）技術(shù)對含礦物類中藥配方顆粒的化學(xué)成分進(jìn)行對比研究，探索含礦物類中藥復(fù)方單煎、合煎在化學(xué)成分方面的差異性，為中藥的臨床安全應(yīng)用提供參考。

1 儀器與實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

Agilent 1290 超高效液相色譜儀；DAD 紫外檢測器（美國Agilent 公司）；XS205DU 電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；KQ700-DE 型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；Thermo Fisher ICAP-Q 電感耦合等離子質(zhì)譜儀；Mlestone Ethos One微波消解儀；Milli-Q Advantage A10 自動純水機(jī)。

1.2 試劑

鈧（Sc）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號：17D4461，規(guī)格：1 000 μg/mL）；銠（Rh）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號：17D5477，規(guī)格：1 000 μg/mL）、錸（Re）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號：17D4136，規(guī)格：1 000 μg/mL）、鈉（Na）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號：15A013-2，規(guī)格：1 000 μg/mL）、鈣（Ca）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號：15A019-2，規(guī)格：1 000 μg/mL）、多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，包括鋁（Al）、鉍（Bi）、鎘（Cd）、鈷（Co）、鎵（Ga）、鋰（Li）、錳（Mn）、鎳（Ni）、鉛（Pb）、銻（Sb）、錫（Sn）、鍶（Sr）、鈦（Ti）、釩（V）（批號：15A008，規(guī)格：500 μg/mL）均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；金（Au）元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號：15042412，規(guī)格：1 000 μg/mL）、汞（Hg）元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號：17111563，規(guī)格：1 000 μg/mL）購自國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院；新芒果苷（批號：RFS-X03211804026，按＞98%計(jì)）、芹糖基甘草苷（批號：G-061-180108，按＞98%計(jì)）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；芒果苷（批號：111607-201704，按98.1%計(jì)）、甘草苷（批號：111610-201607，按93.1%計(jì)）、甘草酸（批號：110731-201720，按97.7%計(jì)）均購自中國食品藥品檢定研究院；硝酸（優(yōu)級純，含量：65.0%-68.0%）、甲醇（分析純）、磷酸（分析純）購自廣州化學(xué)試劑廠；水為超純水。

1.3 藥材

石膏（批號：HX19A01，產(chǎn)地：安徽），購自廣東和翔制藥有限公司；知母（批號：20040201，產(chǎn)地：河北），購自廣東源生泰藥業(yè)有限公司；炙甘草（批號：200602，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古），購自廣州至信中藥飲片有限公司；粳米，市售。

2 方法與結(jié)果

2.1 配方顆粒的制備

2.1.1 合煎顆粒的制備 按處方比例稱取石膏30 g、知母9 g、甘草3 g、粳米6 g，加水1 000 mL 后浸泡30 min，加熱至沸，保持微沸30 min，用紗布趁熱過濾，濾液至蒸發(fā)皿中，水浴濃縮，加入硅藻土拌勻，最后制成10 g 顆粒。分別制備5 批合煎顆粒，編號S1、S2、S3、S4、S5。

2.1.2 單煎顆粒的制備 分別稱取石膏30 g、知母9 g、甘草3 g、粳米6 g，加水600 mL、180 mL、60 mL、120 mL 浸泡30 min，加熱至沸，保持微沸30 min，用紗布趁熱過濾，濾液至蒸發(fā)皿中，分別水浴濃縮，加入硅藻土拌勻，最后制成10 g 顆粒。分別制備5批單煎顆粒，編號S6、S7、S8、S9、S10。

2.2 白虎湯配方顆粒UPLC 指紋圖譜的建立

2.2.1 UPLC 條件 ACQUITYUPLC BEH Shield RP18（150 nm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，以0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B）為流動相，梯度洗脫系統(tǒng)：0～8 min，15%～20%B；8～17 min，20%～23% B；17～30 min，23%～47%；30～35 min，47% B；35～40 min，47%～70%；40～52 min，70%～80%；52～60 min，80%～95%。流速：0.3 mL/min。檢測波長：0～40 min，290 nm；40～60 min，250 nm。柱溫：25 ℃。進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 取配方顆粒約1 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入水25 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷，用水補(bǔ)足減失的重量，過0.22 μm 的微孔濾膜，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 對照品溶液的制備 分別取芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸、芹糖基甘草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成40.31 μg/mL、38.29 μg/mL、40.26 μg/mL、34.35 μg/mL、51.28 μg/mL 的對照品溶液。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取同一批白虎湯配方顆粒供試品（S6），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以10 號峰為參照峰（S），計(jì)算得到共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD 均小于1.96%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批白虎湯配方顆粒供試品（S6），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測定，以10 號峰為參照峰（S），計(jì)算得到共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD 均小于2.47%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批白虎湯配方顆粒供試品（S6），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12、16、18、24 h 進(jìn)樣測定，以10 號峰為參照峰（S），計(jì)算得到共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD均小于2.36%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 指紋圖譜相似度評價 取“2.1”項(xiàng)下制備樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測定，分別進(jìn)樣分析，記錄指紋圖譜、保留時間和峰面積等信息，將10 批白虎湯樣品的指紋圖譜導(dǎo)入《中國色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2012 年版，設(shè)置S1 為參照圖譜，采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動分配（時間窗為0.1 min），用中位數(shù)法生成指紋圖譜，結(jié)果見圖1。10 批白虎湯配方顆粒樣品色譜圖與對照圖譜相似度分別為0.937、0.969、0.980、0.979、0.950、0.925、0.929、0.995、0.992、0.965。

2.2.8 指紋圖譜共有峰的指認(rèn) 通過與對照品圖譜進(jìn)行對比，確定2 號峰為新芒果苷、3 號峰為芒果苷、5 號峰為甘草苷、6 號峰為芹糖基甘草苷、17 號峰為甘草酸，結(jié)果見圖1。

2.3 電感耦合等離子體-質(zhì)譜（ICP-MS）對微量元素的測定

2.3.1 ICP-MS 儀器參數(shù) RF 功率為1 549 W，冷卻氣體流量14 L/min，輔助氣體流量0.8 L/min，噴霧器氣體流量0.99 L/min，泵速40 rpm。以鈧（Sc）、銠（Rh）、錸（Re）單元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 ng/mL）作為在線內(nèi)標(biāo)，在KED 模式下進(jìn)行檢測。

2.3.2 溶液的制備 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密量取多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用10%硝酸溶液稀釋制成每1 mL含各元素為0，5，10，20，50，100，200 ng 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取汞（Hg）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液、鈉（Na）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液、鈣（Ca）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用5%硝酸溶液稀釋制成每1mL 含各元素為0，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 ng 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。混合內(nèi)標(biāo)溶液：精密量取鈧（Sc）、銠（Rh）、錸（Re）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，用10%硝酸溶液稀釋制成每1 mL 各含10 ng 混合溶液，搖勻，即得。

空白溶液的制備：精密量取硝酸8 mL，置于耐壓耐高溫微波消解罐中，按設(shè)定的微波消解條件進(jìn)行消解，消解完全后，消解液冷卻至60 ℃以下，取出消解罐，放冷，將消解液轉(zhuǎn)入50 mL 容量瓶中，少量水洗滌消解罐3 次，合并至容量瓶中，用水定容，混勻，即得。樣品預(yù)處理：精密稱取樣品0.2 g，置于耐壓耐高溫微波消解罐中，精密量取硝酸8 mL 于消解罐中（反應(yīng)劇烈，放置至反應(yīng)停止）。按設(shè)定的微波消解條件（5 min 升溫至130 ℃，維持5 min，隨后8 min 升溫至190 ℃，維持10 min 消解）進(jìn)行消解，消解完全后，消解液冷卻至60 ℃以下，取出消解罐，放冷，將消解液轉(zhuǎn)入50 mL 容量瓶中，少量水洗滌消解罐3 次，移液槍移入200 μL Au 溶液（1 μg/mL），用水定容，混勻，即得消解樣品溶液。

2.3.3 線性關(guān)系考察 將系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液從低至高依次進(jìn)樣，以內(nèi)標(biāo)校正后的響應(yīng)強(qiáng)度值（Y）為縱坐標(biāo)，以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)17 種待測元素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.980，能滿足檢測測試要求，結(jié)果見表1。

表1 17種元素的內(nèi)標(biāo)選擇及線性關(guān)系考察結(jié)果

（續(xù)表）

2.3.4 檢出限 取制備的空白溶液連續(xù)進(jìn)樣11 次，測定各元素的響應(yīng)強(qiáng)度值，17 種元素的檢出限均能滿足分析要求，結(jié)果見表2。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下條件重復(fù)測定6 次，記錄其測定值。結(jié)果見表2。所測的17 種元素的RSD 為0.68%～2.39%，說明該儀器具有較好的精密度。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取S6 樣品25 mL，共6份，制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。所測的17 種元素的RSD 為0.59%～2.56%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S6 樣品，制備樣品溶液，分別于0，2，4，8，16，24 h 后分別測定17 種微量元素的含量，17 種微量元素的RSD 值分別在0.45%～2.71%，結(jié)果見表2，表明樣品在24 h 內(nèi)各元素的量是穩(wěn)定的。

2.3.8 回收率試驗(yàn) 精密移取已知含量的S6 樣品9份，分成3 組，分別精密加入一定量的各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備樣品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，計(jì)算得到各元素的回收率在89.96%～108.33%，RSD 均小于3%，結(jié)果見表2。

表2 17種元素的檢出限、重復(fù)性、精密度結(jié)果

2.3.9 樣品測定 取制備的10 批樣品，制備供試品溶液空白溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 10批消解樣品中17種金屬元素含量測定結(jié)果 mg/kg

2.4 金屬離子對白虎湯的安全評價

參考2015 年版中國藥典一部甘草項(xiàng)下重金屬及有害元素規(guī)定及《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WM2-2001）》限量指標(biāo)：Pb ≤5.0 mg/kg，Cd ≤0.3 mg/kg，Hg ≤0.2 mg/kg，可以得出10 批樣品Pb、Cd、Hg、As 元素的含量均在標(biāo)準(zhǔn)限制范圍內(nèi)，10 批白虎湯配方顆粒中重金屬含量均符合我國重金屬安全性的相關(guān)規(guī)定。

2.5 不同批次的白虎湯配方顆粒單煎與合煎金屬離子濃度比較

通過比較不同批次白虎湯配方顆粒單煎與合煎金屬離子濃度之比，可以看出各批次Li、Na、Al等17 種元素相對百分比均在80%～120%，見表4、圖2。

表4 10批消解樣品中17種金屬元素含量相對比

3 討論

3.1 白虎湯配方顆粒UPLC 指紋圖譜方法的優(yōu)化

考察提取溶劑時，考察了不同體積分?jǐn)?shù)（0、20%、40%、60%、80%、100%）的甲醇對指紋圖譜色譜峰的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以水為溶劑的提取液，指紋圖譜提示各色譜峰吸收強(qiáng)度均較高；同時，對加熱回流提取法和超聲提取法進(jìn)行了對比，結(jié)果兩種提取方法對色譜峰信息無顯著影響，但超聲提取法效率更高，且操作簡便環(huán)保，故選擇超聲提取法作為供試品溶液的提取方法；另外還考察了提取時間（15，30，45 min）的提取效率，結(jié)果表明提取30 min 效果最佳。實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水，甲醇-0.1%甲酸水系統(tǒng)，甲醇-0.1%磷酸水系統(tǒng)，結(jié)果顯示甲醇-0.1%磷酸水系統(tǒng)下，各色譜峰分離度效果更好，峰信號強(qiáng)度更高。

3.2 白虎湯配方顆粒ICP-MS 處理方法的優(yōu)化

考察了不同樣品量（0.2、0.4、0.8、1.0 g）對ICPMS 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品量為0.2 g 時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性不好；當(dāng)樣品量大于0.4 g 時，測定結(jié)果與樣品量為0.4 g，結(jié)果無明顯差異，故選擇0.4 g 樣品進(jìn)行消解。消解可使某些成分消解不完全，消解時考察了加入4 mL 硝酸、8 mL 硝酸后金屬含量濃度的變化，發(fā)現(xiàn)結(jié)果無明顯差異，說明4 mL 硝酸已經(jīng)能夠完全消解樣品。

白虎湯配方顆粒處方中含有石膏，主要金屬離子為鈣離子，通過對10 批結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)單煎與合煎樣品中鈣離子濃度也無明顯差別。

3.3 結(jié)果討論

通過指紋圖譜進(jìn)行相似度比較，不同批次白虎湯配方顆粒單煎與合煎的色譜圖與對照圖譜相似度相均大于0.97；通過對比白虎湯配方顆粒單煎與合煎金屬離子濃度，發(fā)現(xiàn)Li、Na、Al 等17 種金屬元素相對百分比均在80%～120%內(nèi)且相對穩(wěn)定；上述結(jié)果表明白虎湯配方顆粒單煎與合煎化學(xué)成分無明顯差別。

目前臨床廣泛使用的配方顆粒（單味藥材飲片經(jīng)過提取、濃縮制成）和復(fù)方制劑多以水為提取溶劑，但對于中藥中重金屬及有害元素的限定大多指向藥材和飲片，而以水為提取溶劑制備的中藥制劑缺少相關(guān)規(guī)定［9-11］。本實(shí)驗(yàn)中的白虎湯單煎、合煎中17 種金屬元素含量無明顯差別，且含量均符合要求。由此可見，中藥在水煎煮過程中重金屬等有害元素不易溶出，安全穩(wěn)定，結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)的報道［12,13］一致。