不同大小沙田柚品質差異及其分子機理探究

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(1.南寧師范大學廣西地標作物大數據工程技術研究中心,廣西南寧 530001;2.南寧師范大學北部灣環境演變與資源利用教育部重點實驗室,廣西南寧 530001;3.容縣土肥植保經作站,廣西容縣 537500)

沙田柚(Citrusgrandisvar.shatinyu)屬蕓香科柑橘屬,原產地為廣西壯族自治區容縣沙田村,是我國栽培面積最大、產量最高的柚類品種[1]。沙田柚果形碩大,風味獨特清香,一般來說沙田柚果實在常溫可以儲藏4～6個月[2],是柑橘類中耐存儲的品種,有“天然水果罐頭的美譽”[3],沙田柚果實采收后即變為一個獨立的代謝系統,沙田柚品質主要由采收時的品質所決定[4]。

根據前期調研發現,沙田柚果實品質是沙田柚生產中的限制因素,果實過大或過小的沙田柚品質都不佳。前人研究也發現,較大的沙田柚果實品質并非最佳[5],沙田柚果實大小和品質關系目前沒有相關報道。本文以此為切入點對沙田柚果實大小和品質的關系及其可能機理進行研究,以期對沙田柚果樹采摘前疏花疏果管理、采后果實分級,進而對沙田柚經濟效益的提升有所幫助。

本研究以沙田柚為材料,對采后沙田柚品質相關的性狀(可溶性固形物、沙田柚果皮厚度、種子數目、果形指數)和沙田柚大小的關系進行研究,同時對同株果樹上、不同大小的沙田柚進行轉錄組測序,以期對果實重量影響品質的分子機制進行初探。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙田柚 試驗基地依托玉林市容縣容州鎮五一柚場(經度111.33°,緯度22.55°,最高海拔151米),柚場擁有2000株20～30年生成熟沙田柚果樹,2018年11月,按照柚場方位東、南、西和北坡位,隨機等量采收套袋的沙田柚,采后運回室內選擇成熟度較一致、果皮無損傷和無病蟲傷疤的沙田柚果實,試驗可用果實303個。

工業級電子數顯游標卡尺 鋼拓公司;數顯糖度計 FANUOWEI公司;JA2603B電子天平 上海精科天美;HISeq4000測序平臺 美國Illumina;Mastercycler X50h PCR儀器 德國Eppendorf。

1.2 實驗方法

1.2.1 品質指標測定

1.2.1.1 果實總重量(全果,帶果皮)的測定 利用電子天平直接測量;沙田柚大小分組參考中華人民共和國農業行業標準,果實質量等級劃分為900～1099、1100～1299、≥1300 g 三個等級[6],本研究將其細化,以50 g差異為分組標準。

1.2.1.2 可溶性固形物含量測定 取果實赤道附近果肉囊瓣中部的汁胞,每次取樣30 g,置于紗布榨取汁液,而后利用FANUOWEI數顯糖度折射儀器測定可溶性固形物(soluble solid content,SSC)含量,每個果實三次重復[7]。

1.2.1.3 果皮厚度及果形指數的測定 利用四分法對稱切割沙田柚,利用游標卡尺統一測量四份沙田柚縱徑赤道處果皮厚度,取其均值為果皮厚度。利用游標卡尺直接測量果實的橫縱徑[8],果形指數=縱徑/橫徑。

1.2.2 轉錄組測序 為對其采后品質差異機理進行研究,在同一株沙田柚果樹上選850～900、1150～1200 g沙田柚進行轉錄組測序,選三株樹作為三次重復處理。

測序材料前處理:采后沙田柚四分法對稱切割,每份均勻取果肉,裝入50 mL無菌離心管,液氮速凍。

轉錄組測序:轉錄組測序委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成;取RNA 1.5 μg,富集純化后,利用六堿基隨機引物合成cDNA第一鏈,隨后利用DNA聚合酶和RNase H合成cDNA第二鏈,再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA經過修復、A尾接頭后,進行片段大小選擇。而后擴增、純化,得到最終的文庫。文庫構建完成后,把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling后進行Illumina HiSeq測序。

差異表達基因篩選及富集分析:基因差異表達的輸入數據為基因表達水平分析中得到的readcount數據。本研究的兩個組別有三次生物學重復,采用DESeq2[9]進行分析,篩選閾值為padj<0.05且|log2FoldChange|>1。Pathway顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位,應用超幾何檢驗,找出差異基因相對于所有有注釋的基因顯著富集的pathway[10]。

1.3 數據處理

生理指標利用Excel進行數據錄入,利用SPSS 23進行數據處理;利用KAAS軟件進行KEGG注釋,利用Blast2go軟件進行GO注釋,利用DEGSeq2軟件進行差異表達分析。

2 結果與分析

2.1 沙田柚大小與品質相關指標的關系

2.1.1 隨機采摘沙田柚的質量分布 本研究中,303個沙田柚果實質量在817.79～1390.17 g之間,按照重量將沙田柚劃分為10組,其中低于900 g和高于1300 g的沙田柚由于數量相對較少,分為兩組,質量在900 g～1300 g之間的沙田柚以50 g差異為區分,劃分為八組。本研究中,沙田柚的平均質量為1094.95 g,對其進行正態分布檢驗發現,K-S結果sig=0.2>0.05,說明本研究中沙田柚質量分布符合正態分布,質量主要集中在1000～1150 g這3個組別之間,合計162個沙田柚(圖1)。

圖1 不同大小沙田柚數量分布圖Fig.1 Distribution of different sizes of Shatian pomelo

2.1.2 果實大小和可溶性固形物之間的關系 在水果中,可溶性固形物決定了果實的風味和品質[11]。調研發現,在生產實踐中可溶性固形物含量是沙田柚品質評判最直接的指標。本研究中,全部沙田柚可溶性固形物含量值在9.53%～14.83%之間。由圖2可知,各個組別之間可溶性固形物含量均值在11.23%～11.94%之間,950～1000 g組別可溶性固形物含量最高,900～950 g的組別最低,可溶性固形物的平均值為11.55%,對其進行多重比較發現,沙田柚果實并非越大可溶性固形物含量越高,適中大小的沙田柚具有最高的可溶性固形物含量。

圖2 沙田柚大小與可溶性固形物關系Fig.2 The relationship between the size of Shatian pomelo and soluble solids content注:數據代表平均值±標準差;不同字母表示 差異顯著(P<0.05);圖3～圖5同。

2.1.3 果實大小和沙田柚種子數之間的關系 對植物本身來說,無核或少核是一個不利的性狀,但對果實品質來說,無核或少核是一個優良的性狀,該性狀對沙田柚的鮮食或作為原料進行加工有重要意義[12]。沙田柚大小與種子個數關系如圖3所示。本研究中,沙田柚發育完全的種子數目為4～236,平均值為100.27,不同組別之間沙田柚種子數目平均值為58.88～119.45,且隨著重量的增大果實種子數增加,這說明沙田柚果實的生長發育和種子數目存在密切的關系。

圖3 沙田柚大小與種子數關系Fig.3 The relationship between the size of Shatian pomelo and seed number

2.1.4 果實大小和沙田柚果皮厚度之間的關系 沙田柚皮厚增加時,可食率降低[13]。沙田柚大小與沙田柚皮厚度關系如圖4所示。本研究中,沙田柚果皮厚度值在13.97～24.42 mm之間,不同大小的沙田柚果皮厚度平均值在17.52～20.37 mm,平均果皮厚度為18.12 mm,950～1000 g這一組果皮最薄。隨著沙田柚質量的增加,沙田柚果皮厚度增厚。在沙田柚重量1200 g以下時,果皮厚度無顯著變化(P>0.05),沙田柚重量超過1200 g的3組與其他各組之間果皮厚度存在顯著差異(P<0.05)。

圖4 沙田柚大小與沙田柚皮厚度關系Fig.4 The relationship between the size of Shatian pomelo and thickness of the peel

2.1.5 果實大小和沙田柚果形指數之間的關系 果形指數可以體現沙田柚的外觀品質,外觀品質是果實價值的一部分。沙田柚大小與縱橫徑比值的關系如圖5所示。本研究中,沙田柚果形指數在0.94～1.45,果形指數平均值為1.19,不同大小的沙田柚果形指數平均值為1.16～1.23,果形指數隨著沙田柚重量增加波動上升,但各組別之間果形指數無顯著性差異(P>0.05)。

圖5 沙田柚大小果形指數的關系Fig.5 Relationship between the size of Shatian pomelo and fruit-shape index

2.1.6 沙田柚重要指標之間的相關性分析 利用SPSS軟件對沙田柚幾個重要指標進行相關性分析,結果如表1所示。由表1可知,沙田柚果實質量和種子數、縱徑、橫徑、皮厚度四個指標極顯著正相關(P<0.01),這一結果與前文所述結果存在一定的對應性;種子數和可溶性固形物含量極顯著正相關(P<0.01),和皮厚度呈顯著負相關(P<0.05),這一現象可能與種子分泌沙田柚內源激素對果實的調節有關;可溶性固形物含量除和種子數極顯著正相關(P<0.01)外,和果形指數同樣呈極顯著正相關(P<0.01),這為地理標志農產品對容縣沙田柚外觀要求為葫蘆形或梨形的合理性提供直接的證據。

表1 沙田柚重要指標相關性分析Table 1 Correlation analysis of important indexes of Shatian pomelo

注:“*”表示差異顯著(P<0.05),“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

由于全部沙田柚可溶性固形物含量和質量沒有相關性,對其進行分段探討發現,1000 g以下,沙田柚可溶性固形物含量和沙田柚質量極顯著正相關,相關系數達0.4566(P<0.01),950～1150 g之間極顯著負相關,相關系數為-0.2251(P<0.01)。950～1200 g,質量和可溶性固形物含量之間關系為顯著負相關,相關系數為-0.1464(P<0.05)。超過1200 g的組別,質量和可溶性固形物含量之間相關系數沒有達到顯著水平(P>0.05)。

2.2 不同大小的沙田柚轉錄水平的差異

綜合考慮果實重量和可溶性固形物兩個指標,由于可溶性固形物含量在質量超過1200 g和低于950 g的5個組別之間沒有差異,而可溶性固形物值最高的兩個組別與最低的組別質量相鄰,所以選擇850～900 g和1150～1200 g作為小和大兩組沙田柚進行轉錄組測序,分析不同質量沙田柚品質差異的可能原因。

2.2.1 測序結果、質量評估、功能注釋及其分類 本研究中,堿基百分比(Q20)含量在97.73%～98.00%,Q30含量在90%以上,即本研究得到的測序質量較好。組裝獲得Unigene后對基因功能進行注釋,合計注釋 Unigenes數目為31728,所有的Unigenes都被注釋成功。根據Nr庫比對上的物種分布圖如圖6,其中85.1%的Unigenes被柑橘屬植物比對成功,分別是橙子、克萊門柚和溫州蜜柑,另外有0.9%被蓖麻和0.7%被擬南芥比對成功。

圖6 Nr庫比對上的物種分布圖Fig.6 Species distribution map by nr library comparison

對基因做KO注釋后,可根據它們參與的KEGG代謝通路進行分類,合計涉及到5個大類、19個小類,其中涉及到翻譯相關基因的最多,有717個,膜轉運相關的基因最少,有30個,具體結果如圖7所示。

圖7 KEGG代謝通路Fig.7 KEGG metabolic pathway注1:A:細胞進程(Cellular processes);B:環境信息處理(Environmental information processing);C:遺傳信息處理(Genetic information processing);D:新陳代謝(Metabolism);E:生物系統(Organismal systems)。

2.2.2 差異表達基因KEGG富集結果 通過對各測序樣本的檢驗,不同大小的沙田柚之間篩選出差異表達基因969個,其中597個上調基因,372個基因表達下調。通過Pathway顯著性富集能確定差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。差異表達基因涉及82個代謝通路,包括內質網蛋白加工、淀粉與蔗糖代謝、植物激素信號轉導、戊糖和葡糖醛酸鹽相互轉化和半乳糖代謝等。大小不同的沙田柚顯著富集的前20個代謝通路中,有10個與食味品質直接相關,2個與外觀品質直接相關(表1)。

在富集到植物激素信號轉導的差異基因中,涉及7種植物激素和10個基因,這7種植物激素中,生長素(Aux/IAA、SAUR)、細胞分裂素(CRE1、A-ARR)、脫落酸(PYR/PYL)、油菜素內酯(CYCD3)、茉莉酸(JAZ)相關的基因表達下調,乙烯(EIN3、MPK6)和水楊酸(TGA)相關基因表達上調,激素和物質代謝的相互作用可能是產生大小不同沙田柚品質差異的原因。

表2 差異表達基因的代謝通路注釋Table 2 KEGG metabolic pathways annotation of differentially expressed genes

3 討論

3.1 沙田柚果實大小和品質之間的關系

在沙田柚中,可溶性固形物是果實風味和品質的決定性物質,同時也是重要的能源物質,也可以作為中間產物參與到采后果實的物質代謝中,調控果實的采后生理。研究表明,合適大小的臍橙果實品嘗風味更好、可溶性固形物含量更高[14],小果的砂糖橘果實風味和可溶性固形物含量高于大果[15],經過存儲后的椪柑大果風味更優[16]。這些研究表明,大小對柑橘類水果可溶性固形物的影響受到遺傳因素的限制,不同的水果之間具有不同的特性。本研究中,大小適中的沙田柚可溶性固形物含量最高,與在臍橙中的研究結果類似,這一特性可能與在遺傳上沙田柚測序結果與臍橙有最高的相似度有關(32.6%)。

雖然柚子皮有一定的食用和加工價值[17],但柚子皮厚度增加可食率降低,果皮厚度這一性狀不利于沙田柚鮮食。本研究中,1200 g以下組別果皮厚度之間無顯著性差異(P>0.05),超過1200 g的組別隨著果實大小的增大,皮厚不斷增加。對于鮮食類果品,種子多仍然是一個不利性狀,陳建業等研究表明,少核沙田柚與多核沙田柚相比,單果質量顯著性降低,可溶性固形物含量和果皮厚度極顯著降低,其原因可能是激素調節導致[18]。這一結果與本研究的結果類似,本研究側重點為果實大小,大小不同的果實來源于同遺傳背景的沙田柚,得出果重低的沙田柚核少、可溶性固形物含量低和果皮厚度低,結合采摘時轉錄組測序的結果,本研究產生的結果也可能是種子可以分泌植物激素所導致。

3.2 大小不同的果實品質差異可能的分子機理

果實發育是一個動態連續的過程,這一過程中任何一個階段的變化都可能對果實品質產生影響[19],由于全過程的復雜性,本研究選取果形已經確定、果實發育完全的這一個階段進行轉錄組測序,試圖探尋果實大小與品質產生差異可能的分子機理。

植物激素參與植物生長發育的各個階段,影響著果實品質[20]。不論呼吸躍變型果實還是非呼吸躍變型果實,乙烯和脫落酸(ABA)都有促進果實成熟的作用,乙烯在這一過程中起到核心的作用[21-23],在沙田柚中的研究表明,外源乙烯對沙田柚采后品質影響不大,但對沙田柚果實退綠有較大影響[6]。水楊酸有著促進果實膨大、抑制果實成熟的所用,其作用機理可能是抑制乙烯合成完成,油菜素內酯同樣通過抑制乙烯的合成延緩果實的成熟,生長素(IAA)、細胞分裂素在一定程度可以延緩果實的成熟衰老過程[24-27]。本研究發現,富集最顯著的20條pathway中,14條涉及到風味品質相關的物質代謝,2條涉及植物激素相關,分別是植物激素的信號轉導和油菜素內酯的生物合成,在小沙田柚和大沙田柚之間比較,涉及到生長素信號轉導途徑中的Aux/IAA基因和SAUR基因表達下調,涉及細胞分裂素信號轉導途徑中的CRE1基因表達下調,涉及油菜素內酯信號轉導的CYCD3基因表達下調,茉莉酸信號轉導途徑的關鍵組分JAZ基因表達下調,同時涉及乙烯信號轉導途徑中重要的核轉錄因子EIN3表達上調,根據前人的研究結果,以上基因的變化可能促進沙田柚果實的成熟,內源乙烯的變化可能是大、小沙田柚品質產生差異的重要原因。此外,ABA代謝受體PYR/PYL基因表達下調,水楊酸代謝途徑中的TGA基因表達上調,說明了激素調控果實品質的復雜性,其具體機理還需要進一步研究。

4 結論

大小適中的沙田柚,即質量在950～1000 g的沙田柚可溶性固形物含量高,1000 g以下沙田柚可溶性固形物含量值和沙田柚質量極顯著正相關(P<0.01),950～1150 g之間極顯著負相關(P<0.01),950～1200 g之間質量和可溶性固形物含量之間呈顯著負相關(P<0.05)。超過1200 g的組別,質量和可溶性固形物含量之間相關系數沒有達到顯著水平(P>0.05)。沙田柚果實質量和種子數、縱徑、橫徑、皮厚度四個指標極顯著正相關(P<0.01),種子數和可溶性固形物含量呈極顯著正相關(P<0.01),和皮厚呈顯著負相關(P<0.05)。可溶性固形物含量值除和種子數極顯著正相關(P<0.01)外,和果形指數同樣呈極顯著正相關(P<0.01)。對不同大小沙田柚進行轉錄組測序分析,篩選出差異表達基因969個,其中597個上調基因,372個基因表達下調,差異表達基因涉及82個代謝通路,激素和物質代謝的相互作用可能是產生大小不同沙田柚品質差異的原因。本結果可為沙田柚采前疏花疏果和采后激素調節提供參考。