釀酒酵母抗鎘基因CAD1的克隆和分析

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(1.西南林業大學西南地區生物多樣性保育國家林業局重點實驗室,云南昆明 650224;2.西南林業大學西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室,云南昆明 650224)

在自然環境的脅迫下,生物難以維持體內的平衡,甚至可能改變細胞功能和阻礙細胞生長[1]。因此面對環境的脅迫,生物體適應脅迫的能力是其生存和進化的先決條件[2]。真核細胞已經形成了應對機制來對抗各種壓力條件的有害影響,從酵母到人類生物體中的壓力對抗機制是相似的[3]。當釀酒酵母處于惡劣環境中時,會迅速做出反應,細胞可通過協調各執行特定功能的轉錄因子維持其穩態。現已發現釀酒酵母對多種壓力均具有反應機制,通過高度協調的基因表達保持其體內平衡[4]。在面臨環境脅迫時,釀酒酵母具有復雜且非常靈活的基因表達程序,被認為是應激反應機制研究中的模式生物。

目前銅、鐵、鋅等重金屬處于適宜濃度時對人體健康起著重要作用,但高濃度具有極大的毒性,是威脅人類健康的最大風險之一[4]。而鎘(Cd2+)和汞(Hg2+)是非必需的金屬,即使在低濃度下也會對人體造成嚴重的損害[5]。鎘毒性涉及胃腸道、肺、腎和骨等器官以及肺和神經系統[6]。進入人體的鎘,誘導產生活性氧誘導細胞凋亡[7];在體內形成鎘硫蛋白復合物的形式存在于血液中,通過血液到達全身導致這些器官壞死并最終導致死亡[8];鎘也與鈣通道和含鈣蛋白質結合[9];并且在鎘濃度相當情況下,鎘有很強的誘變作用[9]。由于其強烈的致突變潛力,鎘和鎘的化合物被世界衛生組織的國際癌癥研究機構歸類為人類致癌物[10]。

釀酒酵母CAD1基因又名YAP2,由于在細胞中過表達該基因獲得了鎘抗性而被命名為CAD1,所編碼的蛋白是真核細胞中最大的轉錄因子家族之一堿性亮氨酸拉鏈(bZip)蛋白的YAP(“Yeast Activactor Protein”)家族中第二名成員,被廣泛用作模型生物來研究鎘毒性和解毒的分子機制[11]。該基因過表達時可賦予菌株對壓力因子如鎘[12]、黃嘌呤[13]和1,10-菲咯啉[14]等的抗性,說明該基因在對這些有毒物引起的應激反應中能起作用。但該蛋白質的確切作用仍不清楚,仍有待探究。本研究克隆了釀酒酵母CAD1基因,并對其結構和功能進行分析,為后期分析利用該基因用于重金屬鎘的解毒作用及其他有毒物質的抗性研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母菌株BZL06 從香格里拉縣奔子欄鄉葡萄皮上分離并鑒定得到的;酵母膏、蛋白胨、瓊脂、葡萄糖、TIANamp Yeast DNA Kit、RNase A、Lyticase、山梨醇、DNA Buffer 莊盟生物有限公司;核酸染料 Bioteke Corporation;100 bp DNA Marker Biomed公司;Taq酶、d NTP NEB北京分公司;酵母基因組DNA提取試劑盒 北京艾德萊生物科技有限公司;引物 生物工程上海股份有限公司。

Eppendorf低溫高速離心機、DK-8D型電熱恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限公司;SANYO低溫冰箱、Haier冰箱、Y-8型穩壓穩流電泳儀 上海琪特分析儀器有限公司;移液槍 德國Eppendorf公司;Biochrom紫外分光光度計、紫外凝膠成像系統(Alpha Innotech)、Biometra梯度PCR儀、TOMY高壓滅菌鍋、Bio-RAD普通PCR儀、Eppendorf微量移液器、TDA溫度控制儀、SW-CJ-1D潔凈工作臺 江蘇蘇潔凈化設備廠;超微量核酸蛋白檢測儀(Thermo,Nanodrop 2000)、G-BOXF3核酸凝膠成像系統 基因有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 釀酒酵母基因組DNA的獲得 利用酵母基因組DNA提取試劑盒提取高質量的樣品DNA,溶于1×TE緩沖液,并用超微量核酸蛋白檢測儀檢測樣品DNA的濃度[15]。DNA 產物濃度在300 ng/μL左右,OD260/OD280比值為1.87,保存于-20 ℃低溫冰箱中。

1.2.2 釀酒酵母CAD1基因的獲得 使用Primer Premier 5.0設計引物,上游引物為ATGGGCAATA TCCTTCGGAAA,下游引物為CTACAGGAGCTGTC TAACCA。PCR反應體系:7.7 μL dd H2O,1 μL 10×PCR Buffer,0.8 μL dNTPs,正反向引物(10 μmol/L)各0.2 μL,1 μL DNA,0.1 μL Taq酶(高保真)。PCR反應程序:預變性,溫度94 ℃,時長2 min,循環1次;變性,溫度94 ℃,時長30 s,循環35次;退火,溫度55 ℃,時長30 s,循環35次;延伸,溫度72 ℃,時長1 min,循環35次;再延伸,溫度72 ℃,時長5 min,循環1次,溫度4 ℃保存樣品。最終產物保存在-20 ℃的低溫冰箱中[16]。

1.2.3 釀酒酵母CAD1基因染色體定位 PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳檢測后,直接送2個擴增樣品至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序采用正反向測序,并利用config軟件進行處理,以保證其正確性。再通過NCBI功能基因數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/852033)獲得釀酒酵母CAD1基因的基本信息、定位信息和基因結構。

1.2.4CAD1基因的親緣關系分析 將已獲得的CAD1堿基序列翻譯為氨基酸序列利用NCBI網站的Open Reading Frame Finder(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/orffinder/)完成。再將所得到的氨基酸序列導入NCBI-BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)數據庫進行蛋白質的BLAST獲得同源性較高的9條氨基酸序列,進行建樹,分析親緣關系。建樹首先使用ClustalW2對蛋白序列進行多序列比對,再導入Mega6.0(http://www.megasoftware.net/history.php)中,根據NJ方法進行構樹分析[17]。

1.2.5 釀酒酵母CAD1基因的蛋白質一級結構分析

1.2.5.1 理化性質分析 理化性質分析使用ExPASy ProtParam(http://us.expasy.org/tools/protparam. html)。

1.2.5.2 親/疏水性分析 親疏水性分析使用ProtScale(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale. pl)。

1.2.5.3 信號肽(signal peptide)預測 信號肽預測使用SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。

1.2.5.4 亞細胞定位預測 亞細胞定位預測使用PSORT(http://psort.nibb.ac.jp)。

1.2.6 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白質二級結構預測

1.2.6.1 Coil區分析 Coil區分析使用COILS Server(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)。

1.2.6.2 跨膜區分析 跨膜區分析使用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)。

圖2 由CAD1編碼的蛋白質序列Fig.2 Protein sequence encoded by CAD1

1.2.6.3 蛋白質二級結構預測 蛋白質二級結構預測使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl)。

1.2.7 釀酒酵母CAD1基因的蛋白質的結構域預測CAD1基因所編碼的蛋白質的結構域預測利用NCBI數據庫中的Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search. html),結果使用在線工具PROSITE(https://prosite.expasy.org/mydomains)生成圖像。

1.2.8 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白質三級結構預測 釀酒酵母CAD1基因的蛋白質三級結構預測使用同源建模的在線分析工具Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)。

1.2.9 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白質的蛋白互作分析 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白質的蛋白互作分析使用STRING(http://string_db.org/)在線數據庫。

2 結果與分析

2.1 CAD1基因擴增結果和分析

PCR擴增電泳檢測結果如圖1所示,最左邊為Marker:自下至上分別為100、250、500、750、1000、2000 bp,擴增產物。被檢測基因大小為1200 bp左右,與后期測序所得結果相符,初步認定所擴增的產物為目的基因。

圖1 CAD1基因PCR檢測結果Fig.1 PCR test results of CAD1 gene注:M為100 bp DNA Marker;1,空白對照;2和3均為BZL06的CAD1基因PCR擴增產物。

2.2 釀酒酵母CAD1基因染色體定位

在NCBI功能基因數據庫的查詢結果中得到:釀酒酵母CAD1又稱YAP2,蛋白名稱Cad1p,外顯子數:1,全長1230 bp,基因組序列:NC_001136.10,基因編號852033,染色體位置位于Ⅳ染色體1318046～1319275。

2.3 CAD1基因的親緣關系分析

將釀酒酵母CAD1基因的核苷酸序列放入NCBI網站的Open Reading Frame Finder得到所翻譯的蛋白質序列。其分析結果表明,該核苷酸序列含有一個長1230 bp的開放閱讀框,可編碼409個氨基酸。氨基酸序列如圖2所示。

圖3 CAD1基因編碼蛋白親緣關系分析Fig.3 Evolutionary analysis based on CAD1 protein

將釀酒酵母CAD1基因的氨基酸序列提交到NCBI網站中進行蛋白質BLAST。但基因保守性極高,因此選擇同源性較高的幾條與較低的幾條進行親緣關系分析。這九條蛋白質序列進行構建系統發育樹(圖3),進行比對分析親緣性。發現本研究克隆得到的CAD1基因編碼的蛋白與其他4種釀酒酵母的蛋白聚為一類,與其他蛋白的關系較遠。并與釀酒酵母CEN.PK113-7D菌株CAD1蛋白(EIW11633.1)同源性99%最為接近,說明本研究克隆序列正確。且99%的同源性說明該CAD1基因與釀酒酵母CAD1編碼的蛋白質執行的功能相似,即有可能有對壓力因子如鎘、黃嘌呤和1,10-菲咯啉等的抗性,具有提示這些有毒物引起的應激反應中起作用的功能。

2.4 釀酒酵母CAD1基因的蛋白質一級結構分析

2.4.1 理化性質分析 將CAD1基因的氨基酸序列提交到ExPASy ProtParam工具中,從分析結果中,可知CAD1的蛋白質分子式為C1964H3209N573O642S20,包含6408個原子,其分子質量為45762.74;氨基酸數409個,理論等電點pI為6.73;在組成CAD1蛋白的20種氨基酸中亮氨酸的含量最高為9.5%,色氨酸的含量最低為0.7%,不含不常見的氨基酸吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸;不穩定指數51.00,為一個不穩定蛋白質;脂溶指數80.17,平均親水系數-0.645。

2.4.2 親/疏水性分析 將CAD1基因的氨基酸序列提交到ProtScale工具中分析該蛋白的親/疏水性,窗口大小調整為19,圖形輸出如圖4所示。由圖像結果可知,不存在高分值峰(Scare>1.5),因此該蛋白可能不存在潛在的跨膜區,最高峰值0.921位于點282。而5個低分值峰(Scare<0)位于33、44、55、129、241這些氨基酸位點附近,這些區域屬高親水性[18],最低峰值-2.132位于點44、45。從整個圖分析,負值的比重遠大于正值,這與理化性質分析結果中,平均親水系數-0.645結果相符。根據20種氨基酸疏水特性的參數,較高正值的氨基酸具有較強的疏水性,而較低負值的氨基酸具有較強的親水性[19],因此推斷CAD1所編碼的蛋白為親水性蛋白。

圖4 CAD1基因編碼的蛋白質的親疏水性分析Fig.4 Hydrophobicity analysis of proteins encoded by the CAD1 gene

2.4.3 信號肽預測 信號肽通常位于分泌蛋白N端,起到引導蛋白質跨膜轉移到特定亞細胞結構或分泌至胞外的作用,一般以某種分泌蛋白、細胞膜蛋白等形式存在,由16～30個氨基酸組成[18]。由親疏水性和跨膜區分析顯示該蛋白為親水蛋白,因此該蛋白應不含信號肽。將CAD1基因的氨基酸序列提交到SignalP3.0在線軟件工具中進行分析,結果如圖5所示,得出結果該蛋白為非分泌蛋白,存在信號肽概率為0%。

圖5 CAD1蛋白信號肽預測Fig.5 CAD1 protein signal peptide prediction注:S值:信號肽的分值;Y值:綜合剪切位點的分值;C值:原始剪切位點的分值。

2.4.4 亞細胞定位預測 蛋白質的功能與亞細胞定位關系密切,將CAD1基因的氨基酸序列提交到SPROT在線軟件工具中進行該蛋白的信號肽預測。結果表明位于細胞核的可能性為0.87,位于過氧化物酶體中的可能性為4.3%,位于細胞質中的可能性為4.3%,位于細胞骨架中的可能性為4.3%。因此該蛋白極有可能是定位于細胞核中進行代謝調控的轉錄因子。

2.5 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白質二級結構預測

2.5.1 Coil區分析 卷曲螺旋是蛋白質中由兩條及兩條以上的α螺旋鏈互相纏繞形成類似麻花狀結構的超螺旋結構的總稱[18]。主要是一些轉錄因子、骨架蛋白、動力蛋白等含卷曲結構,在機體內執行分子識別、代謝調控、細胞分化等生物學功能[15]。利用COILS在線分析工具,進行該蛋白質的Coil區分析,結果如圖6所示,該蛋白質殘基在50～150區域內,3個不同窗口(Window 14、21、28)均顯示卷曲螺旋。

圖6 CAD1基因編碼蛋白質Coil區分析Fig.6 CAD1 gene encoding protein Coil differentiation

2.5.2 跨膜結構分析 跨膜結構一般由10～20個疏水性氨基酸殘基構成并形成α螺旋結構,進而可以與膜脂緊密結合,最終展示為跨膜蛋白的效應區[20]。將CAD1基因的氨基酸序列提交到TMHMM Server v.2.0在線軟件工具中分析該蛋白質的跨膜螺結構。輸出圖像如圖7所能作為膜受體起作用也可能是定位在膜上的錨定蛋白或離子通道蛋白[21],均不溶于水,所以該預測蛋白質為水溶性蛋白。這些均與親疏水性的分析中的推測結果相符[16]。

圖7 CAD1基因編碼蛋白質的跨膜區分析Fig.7 Transmembrane region analysis of the protein encoded by CAD1 gene注:圖中從上至下的橫線分別表示:outside(膜外)、 transmembrance(跨膜)、inside(膜內)。

2.5.3 蛋白質二級結構預測 蛋白質的二級結構是指多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性結構的構象,主要有α-螺旋(α-helix)、β-折疊(β-sheet)、β-轉角、無規則卷曲(coil)及模體(motif)等組件構成[21]。將CAD1基因的氨基酸序列提交到在線分析工具SPOMA中預測該蛋白質的二級結構,輸出預測結果如圖8所示,統計結果見表1。

圖8 CAD1基因編碼蛋白質的二級結構預測Fig.8 Prediction of secondary structure of protein encoded by CAD1 gene

結構分類個數占比(%)Alpha helix(Hh)18745.72Extended strand(Ee)368.8Beta turn(Tt)153.67Random coil(Cc)17141.81

預測結果中α-螺旋占45.72%,延伸鏈占8.80%,β-轉角占3.67%,隨機卷曲占41.81%。由此可見,在CAD1所編碼的蛋白二級結構中,主要存在α-螺旋和隨機卷曲,β-轉角與延伸鏈分散分布其中。

2.6 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白的結構域預測

結構域是在蛋白質三級結構中介于二級和三級結構之間的可以明顯區分但又相對獨立的折疊單元,每個結構域自身形成緊實的三維結構,可以獨立存在或折疊[15]。將CAD1基因的氨基酸序列提交到NCBI數據庫中的Conserved Domains中。預測得到4個相關結構,結果如表2所示,得到的結果在PROSITE中生成圖像如圖9所示。其中,bZIP_YAP為酵母活化蛋白(YAP)和類似蛋白質的基本亮氨酸拉鏈(bZIP)結構域;BRLZ為基本區域亮氨酸拉鏈的結構域;PAP1為轉錄因子Pap1調節抗氧化劑基因轉錄以響應H2O2,該區域富含半胱氨酸,用半胱氨酸烷化劑處理后半胱氨酸殘基的烷基化可掩蓋核輸出蛋白Crm1的可及性,引發核積累和Pap1依賴性轉錄表達[22];bZIP_1為bZIP轉錄因子Pfam條目包括基本區域和亮氨酸拉鏈區域的結構域。

表2 CAD1編碼蛋白的結構域預測Table 2 Domain prediction of CAD1 encoded proteins

圖9 CAD1基因編碼蛋白的結構域預測Fig.9 Domain prediction of the protein encoded by CAD1 gene

2.7 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白質三級空間結構預測

三級結構是指有特定生物活性、能執行生物的催化功能,并發生充分折疊的完整的三維立結構[23]。利用Swiss-Model進行蛋白質三級空間結構預測分析,結果如圖10所示。

圖10 CAD1基因編碼蛋白質的三級空間結構預測Fig.10 Three-level spatial structure prediction of the protein encoded by CAD1 gene

2.8 釀酒酵母CAD1基因編碼蛋白質的蛋白互作分析

蛋白互作分析有助于研究基因的功能,上游調控因子,下游靶向蛋白,形成復合體發揮功能等。將CAD1基因的氨基酸序列提交到STRING在線數據庫進行分析,選擇蛋白序列分析。選擇僅顯示一級互作且相關性0.7及以上的分析結果,如圖11所示。互作相關性0.7以上的蛋白有9個,其中互作相關性為0.937的SKN7蛋白是CAD1蛋白最好的功能合作伙伴。SKN7蛋白為核反應調節因子和轉錄因子,與Tup1-Cyc8復合物物理相互作用并將Tup1p募集到其靶標;分支雙組分信號系統的一部分,最佳誘導熱休克基因所需的響應/干擾應激、滲透調節;轉錄因子是SLN1-YPD1-SKN7雙組分調節系統的一部分,其控制基因表達以響應細胞外環境的滲透壓的變化。在低滲透條件下,被磷酸化中間體蛋白磷酸化和活化[24]。

圖11 CAD1基因編碼蛋白質的蛋白互作分析Fig.11 Protein interaction analysis of CAD1 gene-encoded proteins

3 討論與結論

釀酒酵母在面臨環境脅迫時擁有非常靈活和復雜的基因表達程序。酵母細胞體內穩態是通過高度協調的轉錄調控機制實現的,涉及多種轉錄因子,每種轉錄因子單獨或組合以完成特定功能[4]。特定的應激形式,大致可以分為三大類:一是熱休克和某些形式的氧化應激,需要激活熱休克因子(HSF),由α-螺旋類DNA結合結構域(DBD),三聚化所需的亮氨酸拉鏈結構域和C末端轉錄激活結構域[25]。二是環境應激反應,HSF非依賴性機制主要由兩個鋅指轉錄因子Msn2和Msn4介導[2]。另一個與HSF無關的機制是由bZIP轉錄因子Yap家族發揮的作用。在釀酒酵母含有的14種bZip蛋白中,有8種是Yap(Yap1-Yap8),形成酵母激活蛋白(Yap)bZIP蛋白家族[26]。這個家族的所有成員都有其關鍵殘基,賦予這些因素不同的DNA結合特性[4]。

CAD1基因編碼的蛋白質為Yap家族的第二成員Yap2p,在細胞核中進行代謝調控的不穩定的親水蛋白;存在明顯的卷曲螺旋區域,不存在跨膜結構,二級結構預測中,α-螺旋和隨機卷曲是主要元件,β-轉角與延伸鏈分散在蛋白中;最為主要的結構域為亮氨酸拉鏈(bZIP)結構域與PAP1結構域,bZIP結構域,結構基序包含堿性區域和亮氨酸拉鏈,其穩定具有平行亮氨酸拉鏈結構域的二聚化。亮氨酸拉鏈的二聚化產生一對相鄰的基本區域,結合DNA并產生構象變化。二聚化以特定且可預測的方式發生,導致數百個二聚體對轉錄具有獨特的作用使其在重金屬鎘與其他有毒物的過表達中存在抗性的表達緊密相關。PAP1區域富含半胱氨酸,在Azevedo等[27]研究發現結構域中含有大量半胱氨酸殘基,鎘可直接與結構域中的殘基結合,產生半胱氨酸衍生化。Cd與這些殘基的結合消除了輸出蛋白Crm1對Cad1p核輸出的識別。在由鎘引起的脅迫下,Cad1p通過Crm1在細胞核中積累,在那里它激活FRM2基因的轉錄。Fmr2p是一種與硝基還原酶同源的蛋白質,其在Cd2+和其他有毒物的抗性作用尚不清楚[14]。鑒于通過Reiser等[28]的研究,已知鎘是通過促進脂質過氧化級聯來發揮其毒性的,因此Cad1p可能是響應鎘而調節脂質代謝,同時FRM2參與脂肪酸信號傳導。在Rodrigues-Pousada等[29]在研究酵母激活蛋白和應激反應中,發現Cad1p的末端富含兩個半胱氨酸的結構域c-CRD和n-CRD區,在用鎘處理后結構域便會被激活,響應表達。Cohen等[30]利用微陣列分析表明,Cad1p可能調節一組基因,這些基因編碼在氧化環境中相互作用并參與穩定和折疊蛋白質。此外,SKN7蛋白與CAD1蛋白的蛋白互作系數為0.937,是與其功能表達關系最為密切的蛋白。SKN7蛋白為核反應調節因子和轉錄因子,與CAD1蛋白在逆境條件下相互作用,可增強其抗性[31]。

目前為止,CAD1的功能仍未明確,但了解這些轉錄因子作用的復雜性以及其過程,對于闡明真核生物中保守的應激反應機理是非常重要的。本研究克隆了釀酒酵母CAD1基因,并利用生物信息學的方法對其結構和功能進行預測分析,我們對其結構和應激反應機理有了更為全面的了解,為今后的鎘抗性研究奠定了一定的基礎。后期分析利用該基因用于重金屬鎘的解毒作用及其他有毒物質的抗性研究打下基礎。