白藜蘆醇通過誘導(dǎo)自噬減少肥胖小鼠骨骼肌組織GDF8表達的研究

費云飛,陳 莉,徐冬梅,曹瓊瓊,徐結(jié)茍,魯云霞

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，安徽 合肥 230032； 2.中國科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，安徽 合肥 230001；3.安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，安徽 合肥 230032)

骨骼肌是糖脂代謝的重要組織，肥胖可造成脂肪組織在肌組織中的積累以及肌肉萎縮，有氧代謝的Ⅰ型纖維減少和酵解代謝的Ⅱ型纖維增加[1]。 白藜蘆醇(resveratrol, RES)具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和延緩衰老等功效，代謝組學(xué)研究揭示RES在腹部肌肉組織中通過調(diào)節(jié)多條代謝途徑和代謝物的水平來降低飲食誘導(dǎo)的代謝風(fēng)險[2]。

自噬-溶酶體系統(tǒng)負(fù)責(zé)肌肉，特別是肌肉萎縮時蛋白質(zhì)的降解，越來越多的證據(jù)表明，自噬為維持肌肉質(zhì)量和肌肉干細(xì)胞的再生功能所必需[3]。已知由白藜蘆醇介導(dǎo)的自噬流恢復(fù)可防止骨骼肌細(xì)胞衰老和改善胰島素抵抗[4]，但白藜蘆醇是否影響肥胖小鼠骨骼肌組織中的自噬尚未見文獻報道。

GDF8(growth differentiation factor 8)基因是轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ 家族的一員，其表達產(chǎn)物myostatin是體內(nèi)重要的肌肉生長抑制因子[5]。肥胖可通過增加GDF8的表達來退行性地減少肌肉的質(zhì)量和功能[6]。已有研究表明GDF8的失活可導(dǎo)致AMPK水平和活性升高，造成骨骼肌的胰島素敏感性增加[7]。我們推測白藜蘆醇可能通過激活骨骼肌組織中的自噬水平來減少GDF8的表達。白藜蘆醇是天然無毒化合物，但作用較緩慢，因此參照文獻選取單一劑量白藜蘆醇(400 mg·kg-1·d-1)灌胃治療20周[8]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 C57 BL/6雄性(♂)清潔級小鼠24只，7 weeks，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(合格證編號SCXK(皖)2011-001)，12 h日/夜交替，自由進食，相對濕度40%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分組進行實驗。

1.1.2藥物與試劑 高脂飼料購自北京峁思倍科生物技術(shù)有限公司，HD001，蛋白質(zhì)19.6%，碳水化合物46.4%，脂肪34.0%。白藜蘆醇(阿拉丁公司，R107315)；RNAStore樣品保存液、TRIzol試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Clontech TaKaRa)；LC3、p62、GDF8引物購自通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司，GAPDH、SIRT1引物購自上海生工生物有限公司。Rabbit Anti-myostatin一抗購于Bioss公司(貨號：bs-1288R)；SIRT1 Mouse mAb、LC3 Rabbit mAb購買于CST公司(貨號：#8459、#4445)，Anti-p62一抗購買于Millipore公司(貨號：#MABC32)；羊抗兔或羊抗鼠酶標(biāo)二抗購自Affinity公司。

1.1.3儀器 羅氏7600 d全自動生化分析儀；TG1650-WS高速離心機(上海盧湘儀有限公司)； 德國萊卡 RM2235型石蠟切片機；TECHNE TC-512 PCR儀(英國公司)；041BR型電泳儀和電轉(zhuǎn)移、電泳槽(BIO-RAD)；Western blot曝光儀(上海勤翔3600型)，凝膠成像儀(上海勤翔GenoSens1580型)。

1.2 方法

1.2.1分組及模型制備 將C57 BL/6小鼠隨機分為標(biāo)準(zhǔn)飲食組(SCD)、標(biāo)準(zhǔn)飲食+胃飼白藜蘆醇組(SCD+RES)、高脂組(HFD)和高脂+胃飼白藜蘆醇組(HFD+RES)。后兩組均為HFD喂養(yǎng)，HFD+RES組和SCD+RES組在HFD和SCD的同時用白藜蘆醇(400 mg·kg-1·d-1)灌胃，治療20周。操作均遵守安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會要求。

1.2.2血清學(xué)指標(biāo)檢測 所有小鼠于前日禁食12小時，稱取體質(zhì)量，2%戊巴比妥腹腔麻醉，腹主動脈負(fù)壓采血，顛倒混勻含有分離膠的真空采血管后靜置，5 000 r·min-1離心10 min，留取血清樣本，分析每只小鼠血清的TG、TC、HDL-C、LDL-C水平。完全剝離小鼠的肌肉組織，1/3的肌肉組織于4%多聚甲醛固定液中固定，1/3的肌肉組織于DEPC水清洗后置于RNA保護液中暫存，轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱中備用，剩余1/3的肌肉組織于液氮中暫存過夜，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3HE染色 制備4%的中性多聚甲醛，取每只小鼠的部分骨骼肌組織，PBS清洗，于固定液中固定，1周內(nèi)更換固定液2～3次，制備組織切片，常規(guī)Hematoxylin-eosin染色，光鏡下觀察，拍照并分析。

1.2.4免疫組化分析 多聚甲醛固定骨骼肌組織，行組織脫水處理，制備包埋塊，連續(xù)厚4 μm切片，脫蠟、脫水處理，免疫組化制片，隨后進行Myostain、SIRT1、LC3、p62的一抗4～8 ℃過夜孵育，二抗室溫孵育，待完成制片，染色后光鏡下觀察，拍照并軟件分析各組積分光密度值(IOD)。

1.2.5RT-PCR 電子天平稱取0.1 g骨骼肌組織，提取Total RNA，測量總RNA濃度，根據(jù)所測濃度調(diào)節(jié)RNA上樣量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在PCR儀上進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，拍照并分析灰度值，以目的基因灰度值/GAPDH灰度值來表示mRNA水平。目的基因及引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for target genes

1.2.6Western blot 每組選取3只小鼠稱取100 mg骨骼肌組織，裂解提取各組骨骼肌組織的Protein，測量各組protein濃度，根據(jù)測量濃度調(diào)節(jié)上樣量，12% SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，于β-actin(1 ∶2 500)、LC3(1 ∶1 000)、p62(1 ∶2 000)、myostatin(1 ∶500)、SIRT1(1 ∶1 000)一抗中，4～8 ℃搖床孵育過夜，漂洗，二抗(1 ∶10 000)室溫2 h，漂洗，顯色成像，Western blot軟件分析灰度值，以目的蛋白 /β-actin來表示目的蛋白水平，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對肥胖小鼠血脂指標(biāo)的影響結(jié)果如Tab 2所示，與SCD組比較，標(biāo)準(zhǔn)飲食的小鼠給予白藜蘆醇胃飼，兩組間小鼠體質(zhì)量和血脂各項指標(biāo)略有變化。然后與SCD組小鼠相比，高脂飲食導(dǎo)致小鼠過度肥胖，其血脂指標(biāo)中HDL-C降低(P<0.05或P<0.01)，同時TC、TG、LDL-C均明顯高于SCD組，對于高脂飲食所致的肥胖小鼠給予白藜蘆醇治療，其血脂指標(biāo)中TC、TG、LDL-C均低于HFD組(P<0.05)，而HDL-C與HFD組比較明顯升高(P<0.05)。

2.2 白藜蘆醇對肥胖小鼠骨骼肌病理學(xué)的影響HE結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)飲食(SCD)小鼠與標(biāo)準(zhǔn)飲食胃飼白藜蘆醇(SCD+RES)小鼠的形態(tài)學(xué)差異無顯著性(P>0.05)。與SCD組相比，高脂飲食所致肥胖小鼠的骨骼肌組織中肌纖維間有明顯的脂質(zhì)沉積。而給予白藜蘆醇治療的小鼠骨骼肌組織的脂質(zhì)沉積消失(Fig 1)。

2.3 白藜蘆醇對肥胖小鼠免疫組化的影響標(biāo)準(zhǔn)飲食和標(biāo)準(zhǔn)飲食胃飼白藜蘆醇兩組小鼠的GDF8、LC3、p62、SIRT1均表達于胞質(zhì)中，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與SCD組相比，HFD所致的肥胖小鼠骨骼肌中GDF8和p62的表達呈增高趨勢(P<0.05，P<0.001)，LC3和SIRT1表達水平相對較低(P<0.05，P<0.01)；而白藜蘆醇治療的肥胖小鼠骨骼肌中GDF8和p62表達明顯下降(P<0.05，P<0.01)，而LC3和SIRT1的表達水平呈增高趨勢(P<0.05)(Fig 2)。

Tab 2 Effects of RES on body mass and serum lipids in hyperlipidemic

*P<0.05,**P<0.01vsSCD;#P<0.05,##P<0.01vsHFD

Fig 1 Morphology of skeletal muscle tissues of mice(HE staining,×400)

Fig 2 Immunohistochemical results of GDF8, LC3, p62, SIRT1 in skeletal muscle tissues of

*P<0.05,**P<0.01vsSCD;#P<0.05,##P<0.01vsHFD. White arrows show positive areas in the skeletal muscle tissues.

2.4 白藜蘆醇對高脂血癥小鼠mRNA表達的影響與SCD組相比，HFD導(dǎo)致小鼠肥胖，進而使骨骼肌中SIRT1、LC3的mRNA 表達降低(P<0.05)，而p62、GDF8的mRNA表達明顯升高(P<0.05)；與HFD組相比，白藜蘆醇治療組骨骼肌中SIRT1、LC3的目的基因表達明顯升高(P<0.05)，p62、GDF8 目的基因表達量降低(P<0.05)(Fig 3)。

2.5 白藜蘆醇對高脂血癥小鼠蛋白質(zhì)表達的作用與標(biāo)準(zhǔn)飲食的小鼠相比，高脂飲食所致的小鼠骨骼肌中SIRT1、LC3 protein相對含量較低(P<0.05)，同時，p62、GDF8 水平相對較高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與HFD組相比，白藜蘆醇治療的肥胖小鼠(HFD+RES)骨骼肌中SIRT1、LC3 蛋白質(zhì)表達升高(P<0.05)，p62、GDF8 蛋白質(zhì)表達明顯降低(P<0.05)(Fig 4)。

3 討論

骨骼肌是參與脂代謝的重要組織，脂類的分解代謝提供了靜息肌肉能量利用的很大比例，但長期的高脂飲食反而會造成骨骼肌的代謝障礙。本實驗結(jié)果顯示，高脂飲食可導(dǎo)致脂肪組織在骨骼肌組織中的積累p62和GDF8的表達升高、伴隨著SIRT1、LC3的表達降低，白藜蘆醇則通過激活骨骼肌組織中SIRT1的表達來促進以LC3II表達升高、p62表達降低為代表的自噬體的形成，以降解高脂飲食時誘導(dǎo)生成的過多的myostatin。

Fig 3 RT-PCR results of GDF8, LC3, p62, SIRT1 in skeletal muscle tissues of

**P<0.01vsSCD;##P<0.01vsHFD

Fig 4 Western blot results of GDF8, LC3, p62, SIRT1 in skeletal muscle tissues of

**P<0.01vsSCD,##P<0.01vsHFD

過度的脂肪攝入通過細(xì)胞損傷和炎癥引起代謝性疾病的進展，此即為“脂毒性”。已有研究表明，高脂飲食可引起腎近曲小管細(xì)胞內(nèi)溶酶體功能的異常，造成自噬流的受損[9]。骨骼肌作為高代謝器官，對高脂飲食中的飽和脂肪酸特別敏感，棕櫚酸可誘導(dǎo)自噬活性降低，表現(xiàn)為減少自噬體形成的標(biāo)志物L(fēng)C3II的表達[10]，白藜蘆醇作為SIRT1 的強激活劑可誘導(dǎo)自噬[11]，與本研究的結(jié)果一致。另有文獻報道白藜蘆醇可通過不同的機制激活A(yù)MPK和SIRT1，上調(diào)Atg5和Atg12的基因表達，增加LC3脂化來調(diào)節(jié)自噬[12-13]。

myostatin是1997年由美國John Hopkins 大學(xué)醫(yī)學(xué)部研究人員在小鼠骨骼肌中發(fā)現(xiàn)的新型生長因子。GDF8 基因缺失可誘導(dǎo)肌肉量增加，降低脂肪含量，抑制飲食引起的肥胖[14]。另一方面，23周的高脂高蔗糖飲食可誘導(dǎo)微型豬的體質(zhì)量增加，脂類在骨骼肌中的異位沉積和肌萎縮，伴隨著GDF8的表達增加[6]。本研究的高脂飲食一共持續(xù)20周，也觀察到類似的現(xiàn)象，提示GDF8可能是治療高脂飲食誘導(dǎo)的骨骼肌代謝障礙的新靶點。

SIRT1在成肌細(xì)胞的增殖和分化中起關(guān)鍵的作用，myostatin則是成肌細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究表明myostatin缺失小鼠的骨骼肌中除AMPK的表達和活性增加外，也顯著增加了AMPK下游SIRT1和PGC1α的表達[7]。SIRT1的抑制劑尼克酰胺可通過SIRT1依賴的方式抑制C2C12細(xì)胞的增殖和促進myostatin的表達，myostatin信號通路的抑制劑SB431542則可逆轉(zhuǎn)尼克酰胺的增殖抑制效應(yīng)，并促進SIRT1的表達[15]。本研究結(jié)果表明，SIRT1激活劑白藜蘆醇可能通過增加SIRT1的表達，改善高脂飲食導(dǎo)致的自噬流受損，進而促進myostatin的降解；經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，此研究尚未見文獻報道。

SIRT1是AMPK信號通路下游的一個靶基因， 本研究未能探究白藜蘆醇治療的肥胖小鼠骨骼肌中AMPK的表達和活性的變化，并進一步探索GDF8與AMPK信號通路的關(guān)系，這將是本實驗后期的主要研究內(nèi)容。

綜上所述，白藜蘆醇對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的骨骼肌組織有保護作用，其機制可能與促進SIRT1的表達，誘導(dǎo)自噬活性升高，進而減少GDF8的表達有關(guān)。本實驗結(jié)果可為白藜蘆醇的臨床應(yīng)用于肥胖狀態(tài)下的骨骼肌萎縮等疾病治療提供科學(xué)依據(jù)，同時也為白藜蘆醇預(yù)防高脂飲食下骨骼肌萎縮的具體作用機制研究奠定基礎(chǔ)。