牙本質磷蛋白在牙組織仿生礦化中的研究進展

楊 陽 陳永進 張 旻

牙本質基質中含有多種非膠原蛋白(NCP)，是牙本質礦化的重要調控因子。多數NCP被認為有高度酸性，可以為羥基磷灰石晶體成核和成熟提供動力并減少激活能，這些都歸功于其所含有的天冬氨酸、谷氨酸和絲氨酸等。牙本質磷蛋白(dentin phosphoprotein，DPP)作為最重要的一種非膠原蛋白，是牙本質涎磷蛋白的裂解產物，能夠參與纖維內礦化，礦物晶體的初步形成及成熟等過程，在牙本質的再礦化過程中發揮非常關鍵的作用[1]。

一、牙本質磷蛋白的結構和功能

1.牙本質磷蛋白(DPP)的結構：DPP中含有豐富的磷酸化的絲氨酸(45%～50%)和天冬氨酸(35%～38%),這些氨基酸以重復序列(Asp-Pse-Pse)n即(DSS)n，3≤n≤14,以及(Asp-Pse)m即(SD)m，m=2或3出現，使得DPP帶有非常多的陰離子，并有很強的鈣離子結合能力[2]。不同物種之間，DPP的等電點均有所不同，比如大鼠的為1.10，人的為2.65。許多證據表明，DPP由成牙本質細胞合成后，經過高爾基體轉送，并由細胞突輸送至礦化牙本質前緣，并在此處分泌至細胞外基質并與膠原直接結合[3]。DPP以可溶和不可溶兩種形式存在于牙本質基質中：可溶性DPP指只使用一般方法(如中性EDTA，0.6mol/L HCl等)處理牙本質就可以從牙本質中釋放的部分；不可溶性DPP與膠原結合緊密，只有使用一些變性劑如鹽酸呱啶等使膠原變性后，才能少量釋放。可溶性DPP的數量較不可溶性DPP的數量較多，盡管二者的存在形式、數量均不同，但其氨基酸組成相似。

根據文獻報道，不同種屬動物的DPP相對分子質量明顯不同，即使是相同種屬動物的DPP相對分子質量也可以不同。這種結果可能是種屬差異造成的，也可能是提取DPP的方法不同導致的。MacDougall等[4]認為翻譯后的修飾即磷酸化造成了不同種屬動物DPP分子的不同。也有研究者認為DPP相對分子質量的不同也可能是由于提取過程中蛋白的降解或在進行聚丙烯酰氨凝膠電泳走膠時蛋白行為的異常引起的。

2.DPP的功能：DPP中含有許多特殊的氨基酸序列，即由絲氨酸(S)和天冬氨酸(D)形成的DSS序列，其磷酸根和羧酸根在肽鏈兩側形成許多突出的嵴，是鈣離子的高結合位點，可以在此部位誘導羥基磷灰石晶體成核；DPP與細胞外基質中的膠原結合后還可以調控羥基磷灰石晶體的生長和成熟[5]。研究表明，溶液中游離的DPP分子可以抑制羥基磷灰石晶體的形成，而當DPP固定于人工支持物表面或擴散到凝膠體系時，低濃度可以促進羥基磷灰石的形成，高濃度反而抑制其形成和生長[3,6]。因此，可以說體內牙本質生物礦化過程中，DPP發揮雙重作用。DPP與Ⅰ型膠原纖維結合后能形成一種新的蛋白排布，這種新的三維結構可以更好地結合鈣離子和磷酸鹽進而促進羥基磷灰石初始晶體的形成；隨著礦化的不斷發生，高濃度的DPP與正在生長的晶體結合，抑制或減緩晶體的生長速度，從而影響晶體的形狀和大小。

二、仿生礦化研究概況

1.生物礦化和仿生礦化的定義：生物礦化是指在細胞的參與下，環境中的無機離子選擇性地沉積于特定的有機基質的表面，從而形成礦物質的過程，其實質為在生物體內所進行的晶體生長過程。根據受生物控制的程度Lowenstam把生物礦化過程分為生物誘導(biologically induced)礦化和有機基質調控(organic matrix mediated)礦化兩種作用類型。生物礦化中晶體的形成主要包括以下幾個步驟：在基質內蛋白表面形成晶核(即成核)；晶核成長為微晶并發育成熟(即晶核生長)；在某些因素的作用下小顆粒集聚并沉淀(即集聚)；形成的無定型磷酸鈣和磷酸八鈣在環境中pH值、溫度、Ca、P等濃度的影響下轉換為羥基磷灰石晶體(即固相轉換)。生物礦化的過程主要是通過有機基質、細胞以及基因來進行調控的。

仿生礦化(biomimetic mineralization)指通過模擬生物體的生物礦化，以有機基質作為模板，對無機物的形成和生長進行調控，從而在體外合成類骨及類牙樣物質。通過仿生礦化可以制備具有獨特的微觀結構和生物性能的材料。仿生礦化的過程主要包括以下步驟：①有機大分子自組裝為無機物的成核提供模板；②無機物在有機模板的端點與其相互識別，并在此部位迅速沉積；③有機模板的自組裝過程持續進行并通過靜電作用、電荷、極性等對無機礦物的生長進行調控；④最后亞單元礦物組裝形成與自然生物礦物結構相類似的礦物質[7]。Kikuchi等[8]已經使用仿生合成技術合成了一種HAp/Col的復合物，這種復合物與骨的微觀結構相似，所形成的直徑只有50～100nm的片狀羥基磷灰石晶體的c軸與Col纖維長軸平行排列。這種復合物被納入骨的重建過程后，可以被破骨細胞吸收并被成骨細胞形成新骨，就好像移植自體骨一樣[9]。

2.仿生礦化體外模型:在仿生礦化相關的體外研究中，體外礦化模型是獲得研究結果所必不可少的。目前應用最多的仿生礦化系統包括有機基質調控體系、有序膜模擬體系、凝膠礦化模型以及以陽離子選擇膜為基礎的雙膜礦化系統，利用這些體外礦化模型能夠有效的進行仿生礦化的研究。

(1)有機基質調控下進行的仿生礦化:這種研究方法主要是直接采用生物體內的有機基質進行體外模擬合成無機礦物。已經有研究表明，利用膠原纖維作為有機基質模板可以在體外成功的合成羥基磷灰石晶體和氟磷灰石晶體[10]。自組裝的釉原蛋白也可以誘導和控制羥基磷灰石的形成[11]。王天達等[12]和Coelfen[13]總結出在膠原纖維的礦化過程中，磷酸鈣微晶開始在復雜的聚合結構間形成穩定的礦化物滴，隨后礦化物滴在膠原纖維表面和膠原內部的獨特區域結合膠原分子，膠原纖維內部的液態礦化物滴彌散于膠原纖纖維固化為不定型的晶相，最后，在膠原有序化結構的引導下，不定型的礦化物晶相轉變為定向的一定結構的磷灰石晶體。

(2)有序分子膜模型:有序分子膜體系就是單分子膜，具有非常規則的結構排布，為晶體生長提供了良好的模板能較好的模擬生物礦化過程。目前，LB膜和自組裝單分子膜是有序分子膜的兩種基本形式。

LB膜(Langmuir-Blogett film)是在20世紀30年代由Langmuir和Blogett共同建立的，即將兩親分子在氣/水界面通過水平加壓使分子緊密有序排列而形成有序單分子膜，利用LB 膜技術進行生物礦化已成為生物礦化仿生合成的一種重要方法。Kimiyasu等[14]在玻璃表面形成花生酸LB膜，并浸泡于模擬體液中，之后通過掃描電鏡、透射電鏡等觀察發現LB膜上有羥基磷灰石晶體形成。此外，還有研究者通過采用Langmuir-Blodgett(LB)技術在不銹鋼和鈦表面沉積了一種化學結構簡單的磷脂磷酸二十六烷基，利用該機制生成了碳化羥基磷灰石[15,16]。

自組裝單分子膜(self-assembled monolayers，SAMs)是近年來發展起來的一種新型有機超薄膜，在SAMs膜的表面反應物能夠富集、定位并被催化。有研究發現在室溫下Ca/P摩爾比為1.66的礦化液中，以玻片表面形成的硬脂酸自組裝膜為模板成功地誘導了碳酸磷灰石薄膜的形成[17]。Wu等[18,19]在鈦板表面形成的磷酸(含有16個碳原子烷基)自組裝單分子膜能夠有效地促進HA晶體的沉積。

(3)凝膠礦化模型:凝膠法是以凝膠作為擴散和支持介質，來模擬生物礦化的一種重要的方法。已經有許多研究利用凝膠法來探索仿生礦化過程，如Boskey等[20]建立了凝膠和瓊脂擴散體系，并且證明了非膠原蛋白在羥基磷灰石晶體形成過程中所起的促進或抑制作用。Hunter等[21]利用丙烯酰胺凝膠體系來探索體外的礦化過程。Gajjeraman等[22]用硅膠鹽凝膠作為晶體形成的介質來研究HA晶體的形成。

(4)雙膜體系:雙膜系統是近年來出現的一種新的體外礦化模型，由陽離子選擇膜(cation-selective membrane)和透析膜(dialysis membrane)組成，在陽離子選擇膜和透析膜之間形成反應腔隙，鈣離子溶液通過陽離子選擇性膜進入反應腔隙，磷酸根離子透過透析膜進入反應腔隙。目前，應用于牙齒生物礦化研究的多為雙膜系統。Iijima等[23]在雙膜系統中利用豬釉原蛋白和氟離子作為牙釉質形成的模型，豬釉原蛋白和氟離子的結合會在調節習慣、尺寸定位及鈣磷晶體形成階段起到協同作用，從而形成類似于真實牙釉質晶體的棒狀磷灰石晶體。

三、牙本質磷蛋白在牙組織仿生礦化中的研究進展

牙齒是人體唯一無細胞性，由外胚葉和間質來源的堅硬組織，結構相對較簡單。牙體硬組織被破壞后是無法再生的。目前，大多數的牙體組織缺損修復均是使用復合樹脂、生物陶瓷等材料，但是這些材料與牙體組織在結構、組成以及性質等方面均有很大的差異；而且這些修復材料與牙體組織之間存在的界面問題，可引起邊緣微滲漏、牙本質過敏、繼發齲等問題。因此，探尋一種可以使牙體組織“再生”的方法成為牙體硬組織缺損修復的關鍵。近年來，隨著仿生合成技術的迅速發展和成熟，一些研究者將目光放在仿生礦化上，以期在體外合成類牙體硬組織樣的結構，用于修復各種原因引起的牙體硬組織的缺損。

NCPs如磷蛋白、骨橋蛋白、骨結合蛋白、骨鈣素等均富含酸性氨基酸，尤其是天冬氨酸和磷酸化的絲氨酸，被稱為陰聚離子蛋白。這些蛋白參與幾乎所有生物的礦化過程，這些聚陰離子蛋白可與膠原結合并結合鈣磷離子從而誘導晶體形成；而在可溶性條件下又可抑制鈣磷離子沉積于已形成的晶體上。有研究證實，在鈣磷酸鹽飽和溶液中加入Ⅰ型膠原和天冬氨酸陰離子模擬礦化環境中的富含天冬氨酸的NCPs，可以誘導礦化并在初期形成無定型磷酸鈣，并很快就在膠原支架中形成有序的類似骨的礦化[24]。

目前，DPP作為牙本質中最重要的NCPs，被認為是唯一的能夠形成類似于發育中的骨中所包含的礦化結節的蛋白，已經被證實在牙齒的仿生礦化中起關鍵性作用，并且將其引入組織工程中能促進誘導仿生礦物質的形成。DPP與Ⅰ型膠原結合，并在該處結合鈣離子從而促進HA在此處成核，DPP是羥基磷灰石晶體的形成和生長的一個重要的引發劑和調制器。體外研究表明，在中性pH值及較低的DPP/膠原比例時，在距離N-末端210nm處會產生唯一的結合位點，可以誘導膠原的局部構想發生改變，使分子彎曲并減少其有效長度；當DPP/膠原比例較高時，DPP可以結合所有的膠原纖維[25]。分子圖形進一步表明，與膠原纖維比較DPP中羧酸與磷酸集團之間的間隔可能是決定晶體生長取向所必需的，DPP可能提供礦物晶體與膠原纖維之間的內在聯系[26]。體外成核現象表明，自然來源的DPP可以誘導羥基磷灰石成核，且這種晶體與礦化牙本質中的晶體有相似的形態結構；但是重組的DPP只能形成無定型磷酸鈣[27]。Suzuki等[28]通過研究DPP基因敲除的小鼠的牙齒，結果表明DPP在礦物成熟過程中(如系統有序地組裝晶體結構中)是必不可少的。Sfeir等[29]研究發現在NIH3T3細胞中，DPP的表達可以誘導細胞基質礦化形成礦物結節，這些結節通過X線衍射被證實為羥基磷灰石晶體。Deshpande等[2]研究表明非磷酸化的DPP不能影響膠原礦化，而磷酸化的DPP能夠導致類似牙齒中的高度礦化膠原纖維的形成；不同濃度的DPP及其磷酸化的程度不同會導致不同礦物相的形成。最新的研究表明，在松散排列的膠原纖維涂層中加入DPP可以誘導產生礦物結節，這些礦物結節是在骨發育中可以看到的；除此之外，這些礦物結節中的Ca∶P比例明顯高于正常骨組織中的[26]。DPP還是骨形態發生蛋白-2(BMP-2)信號通路的共激活劑，在調節信號通路方面具有潛在作用。

綜上所述，生物礦化發展幾十年來，研究者提出了各種模型來研究和了解生物調控機制，但由于其復雜性，精確的分子機制還不是非常清楚。牙本質磷蛋白雖然已經被證實了在生物礦化中發揮重要的作用，但其作用機制、關鍵結構等尚不明確，因此需要在更接近口腔環境的條件下進一步研究DPP的關鍵結構、調控機制等，為開發仿生材料實現牙體硬組織再生奠定基礎。