復合真菌多糖體外抗氧化活性研究

王晴 曹穩根 錢玉梅 李紅俠 翟科峰 陳紅玲

摘 要：以黑木耳、銀耳、香菇為材料，采用超聲波輔助水提法制備三種真菌多糖，并按等體積比制備復合真菌多糖，通過比較對DPPH、·OH、O2-·、ABTS+自由基的清除作用，考察復合真菌多糖與單一真菌多糖抗氧化活性強弱.結果表明：復合真菌多糖對DPPH、·OH、O2-·、ABTS+自由基清除作用高于黑木耳多糖、銀耳多糖、香菇多糖，呈現協同作用，為真菌多糖的高效利用及復合真菌多糖的進一步開發應用提供理論依據.

關鍵詞：多糖;復合;真菌;抗氧化

中圖分類號：S646? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2020）01-0063-03

真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體或其發酵液中提取得到，主鏈由β-D型葡萄糖基連接而成，人體必不可少的一種高分子活性聚合物[1].目前國內外研究表明，真菌多糖可發揮多種功能：改變細胞膜成分、影響細胞信號傳遞、誘導細胞凋亡和分化等來抵御、預防腫瘤威脅，發揮抗腫瘤作用[2];激活巨噬細胞、活化淋巴細胞以及加強某些細胞因子等，提高機體免疫力[3];與自由基結合、形成抑制物阻止氧化、促進抗氧化酶生成以及提高抗氧化酶活性，具有抗氧化能力等[4].真菌多糖的相關研究正在火熱進行，從真菌多糖的生理學功能、應用領域到如何合理制備來提高其生理活性，其中關于復合真菌多糖的優異性已經受到各界學者的重視.于沖等人[5]將五種不同的真菌多糖按不同比例復合后，通過測定兩種抗氧化指標，結果表明復合后的真菌多糖清除自由基的效果更佳，基本呈現協同增長，由此可見復合真菌多糖具有較好的開發及應用前景.

以黑木耳、銀耳、香菇為原料，采用超聲輔助水提法制備三種真菌多糖，按等體積比混合得到復合真菌多糖，通過比較對DPPH、·OH、O2-·、ABTS+自由基的清除作用，考察復合真菌多糖與單一真菌多糖抗氧化活性強弱，為復合真菌多糖進一步研究和應用提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗材料木耳、銀耳、香菇均為市售;試驗試劑葡萄糖、苯酚、水楊酸、焦性沒食子酸、硫酸均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司;DPPH購于上海源葉生物科技有限公司;ABTS購于合肥巴斯夫生物科技有限公司;其他試劑均為分析純.

1.2 試驗儀器

DHG-9030A型鼓風干燥箱（上海精密儀器儀表有限公司）;XL-04B中草藥粉碎機（廣州旭眾食品機械有限公司）;JY96-IIN超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;SHZ-D（III）循環水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）;R-1001LN旋轉蒸發儀（鄭州長城科工有限公司）;SC-3612低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）等.

1.3 試驗方法

1.3.1 真菌預處理

分別將木耳、銀耳、香菇洗凈、剪碎，置于50℃干燥箱中干燥6h，粉碎，過80目篩，按料液比1：20（g/mL）加入90%乙醇，浸提過夜，2700g下離心15min，棄上清液并將殘渣自然風干后分別得木耳、銀耳、香菇預處理粉末.

1.3.2 真菌多糖提取

分別取木耳、銀耳和香菇預處理粉末3g，按料液比1：30（g/mL）加入蒸餾水，在超聲功率580W，超聲時間1h條件下超聲提取，2700g離心15min，取上清，濃縮，抽濾，定容至100mL，分別得木耳、銀耳、香菇多糖提取液[6].

1.3.3 真菌多糖濃度及得率測定

按廖彭瑩等[7]的方法繪制葡萄糖標準曲線，分別取木耳、銀耳、香菇多糖提取液稀釋至適宜倍數，按制作葡萄糖標準曲線的方法，測定吸光值，根據標準曲線及稀釋倍數計算得到提取液多糖濃度，并按下式計算銀耳、木耳、香菇多糖得率：

真菌多糖得率（%）=（c×n×V/m）×100

式中c為由標準曲線計算得到的稀釋后的真菌多糖濃度，mg/mL;n為真菌多糖提取液稀釋倍數;V為真菌多糖提取液總體積，mL;m為真菌質量，g.

1.3.4 復合真菌多糖的制備及抗氧化能力測定

將木耳、銀耳、香菇多糖提取液按等體積比（1：1：1）混合，搖勻，制備濃度分別為0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL的復合真菌多糖，按王金璽的方法測定復合真菌多糖及與其相同濃度的木耳多糖、銀耳多糖、香菇多糖對DPPH自由基清除率[8];制備濃度分別為1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL的復合真菌多糖，按劉丹丹[9]和許女[10]的方法測定復合真菌多糖及與其相同濃度的木耳多糖、銀耳多糖、香菇多糖對·OH自由基清除率;制備濃度分別為0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的復合真菌多糖，按段笑影等的方法測定復合真菌多糖及與其相同濃度的木耳多糖、銀耳多糖、香菇多糖對O2-·自由基清除率[11];制備濃度分別為1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL的復合真菌多糖，按楊卓等的方法測定復合真菌多糖及與其相同濃度的木耳多糖、銀耳多糖、香菇多糖對定ABTS+自由基清除率[12].

2 結果與分析

2.1 真菌多糖濃度及得率

超聲波是一種高頻率機械波，能夠通過超聲空化作用向受作用體系提供高能量，從而加速真菌多糖的溶出，此外，超聲波的次級效應如機械振動、擊碎、擴散、乳化、化學效應等也能加速多糖的擴散、釋放并使之與溶劑充分混合，有利于多糖提取[13].由表1可知，在超聲功率580W，超聲時間1h的條件下，三種真菌多糖得率具有顯著性差異（P<0.05），其中木耳多糖得率最高，銀耳多糖次之，香菇多糖得率最低，可能由于超聲波對不同真菌組織和細胞壁的破壞程度有所差異，對細胞膜穿透能力和多糖被動運輸能力影響不同而造成.

2.2 復合真菌多糖對DPPH自由基清除作用

DPPH是一種氮中心自由基，對蛋白質、脂質、核酸等大分子具有攻擊作用，從而引發機體病變[14].由圖1可知，三種真菌多糖對DPPH自由基清除能力從大到小為：銀耳多糖>木耳多糖>香菇多糖，但復合真菌多糖對DPPH自由基清除能力均高于任意單一多糖，且多糖濃度在0.1～0.5mg/mL時，清除率基本穩定在70%以上，隨多糖濃度的升高清除率變化較小.

2.3 復合真菌多糖對？OH自由基清除作用

羥自由基是由過氧化氫釋放出的氧化能力和毒性較強、較活潑的活性氧自由基，能夠氧化機體內的蛋白質、脂質、核酸等生物大分子，造成人體組織中脂質的過氧化、核酸的斷裂、多糖和蛋白質的分解，從而導致機體受損和基因突變，引起機體衰老和癌變[15].由圖2可知，當多糖濃度為1.0mg/mL時，木耳多糖、香菇多糖、銀耳多糖對·OH自由基清除作用較低，清除率分別為23%、21.82%、22.38%，而復合真菌多糖清除率為48.68%.對·OH自由基清除作用大小為：復合真菌多糖>香菇多糖>銀耳多糖>木耳多糖.

2.4 復合真菌多糖對O2-·自由基清除作用

超氧陰離子自由基是生命體代謝過程中產生的一種氧化能力較強的活性氧自由基，在機體中存在壽命最長，能引發體內脂質過氧化，加快機體衰老過程，并可誘發皮膚病變、心血管疾病、癌癥等[16].圖3表明，對O2-·自由基清除作用大小為：復合真菌多糖>香菇多糖>銀耳多糖>木耳多糖，復合真菌多糖真高清除為最高達到80.42%.

2.5 復合真菌多糖對ABTS+自由基清除作用

ABTS在適宜條件下被氧化會生成穩定綠色的ABTS+，在734nm下有特征吸收峰，加入抗氧化物質會抑制綠色ABTS+自由基的生成，使顏色減弱.對ABTS+的清除能力能反映出抗氧化物質的抗氧化能力[14].圖4表明，在多糖濃度為1.0～2.0mg/mL，復合真菌多糖對ABTS+清除作用均在90%以上，且高于其他三種單一真菌多糖，當多糖濃度為1.2mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL時，復合真菌多糖對ABTS+清除率清除作用甚至超過Vc.ABTS+自由基清除能力大小為：復合真菌多糖>香菇多糖>木耳多糖>銀耳多糖.

3 結論與討論

真菌多糖具有豐富的生物活性，并且無毒副作用，是當前最具開發潛力的功能性食品的新資源[17].自由基是共價鍵發生均裂而形成的具有不成對電子的原子或基團，化學性質極活潑，如果體內大量自由基存在，會與脫氧核糖核酸、蛋白質、脂質等生物大分子發生反應，造成器官、組織和細胞的功能衰退，引起一系列慢性疾病，并且加速衰老[18].大量研究表明，真菌多糖具有清除自由基作用，且不同真菌多糖的復合，其作用可互補和協同[19]，因此復合真菌多糖的抗氧化活性研究，在真菌多糖的開發與應用中具有重要的意義.

利用超聲波輔助水提法制備木耳多糖、香菇多糖、銀耳多糖，并按等體積比制備復合真菌多糖，通過對DPPH、·OH、O2-·、ABTS+自由基的清除作用的考察，得到復合真菌多糖對四種自由基清除能力均高于三種單一真菌多糖，呈現出協同作用，表明復合真菌多糖的抗氧化作用并非是真菌多糖成分的簡單疊加，各種成分間存在著相輔相成、相互為用的關系，其相加、協同或拮抗作用不容忽視，且采用何種方式組合配伍能最大程度提高復合多糖活性至關重要，且具有巨大的經濟價值，仍需進一步探索.

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