一株植物乳桿菌的抑菌物質(zhì)性質(zhì)研究及抑菌條件優(yōu)化

姚沛琳 張凱迪 張新劍 韓盼盼

摘 要：以傳統(tǒng)發(fā)酵食品為篩選源，獲得50株乳酸菌，采用牛津杯方法篩選出一株抑菌性能較好的植物乳桿菌7-1，抑菌圈直徑為15.24mm，并且邊緣清晰.然后對(duì)植物乳桿菌7-1的抑菌物質(zhì)進(jìn)行性質(zhì)研究和抑菌條件優(yōu)化，為天然生物防腐劑的研究提供參考.結(jié)果表明：該菌產(chǎn)生的細(xì)菌素，熱穩(wěn)定性良好，在酸性條件下保持較高抑菌活性，經(jīng)蛋白酶處理后抑菌活性幾乎喪失.采用單因素正交實(shí)驗(yàn)對(duì)該菌產(chǎn)細(xì)菌素條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果為：葡萄糖為碳源、培養(yǎng)基初始pH為7、培養(yǎng)時(shí)間為36h，抑菌圈直徑為19.6mm，邊緣清晰.這一結(jié)果為天然生物防腐劑的研究提供了一個(gè)新的菌株和參考，豐富了天然生物防腐劑研究文庫(kù).

關(guān)鍵詞：乳酸菌;分離鑒定;抑菌;優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TS202.3? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2020）01-0070-04

乳酸菌是一類可以通過(guò)利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌[1]，在自然界中分布十分廣泛[2].因其具有很好的益生作用，被廣泛應(yīng)用于食品等與人類相關(guān)的產(chǎn)業(yè).

乳酸菌能夠抑制腐敗菌和病原菌的生長(zhǎng)，從而達(dá)到防止腐敗變質(zhì)、延長(zhǎng)保質(zhì)期的作用[3-4].因此，乳酸菌被公認(rèn)為是最具有潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值的天然生物防腐劑[5-7].經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在代謝過(guò)程中可產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì).其產(chǎn)生的酸性物質(zhì)可顯著降低環(huán)境的pH值和Eh（氧化還原電位）值，讓環(huán)境保持酸性，從而對(duì)致病菌產(chǎn)生拮抗作用，以達(dá)到抑菌目的[8].其產(chǎn)生的過(guò)氧化氫因?yàn)闆](méi)有過(guò)氧化氫酶的存在，從而可以在食物環(huán)境中不斷積累，進(jìn)而對(duì)其他微生物產(chǎn)生抑制作用[9].在這些抑菌物質(zhì)中起主要作用的是一種被稱為細(xì)菌素的物質(zhì).細(xì)菌素是由某些細(xì)菌在代謝過(guò)程中經(jīng)核糖體合成的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白質(zhì)類物質(zhì)[10-11].因?yàn)榧?xì)菌素具有強(qiáng)抑菌性且無(wú)抗藥性，完全彌補(bǔ)了傳統(tǒng)抗生素的缺陷，因此被認(rèn)為是“抗生素的理想替代品”，得到人們的廣泛關(guān)注.

隨著人們對(duì)食品安全的關(guān)注以及抗生素的濫用產(chǎn)生的抗性，人們一直在努力尋找一種可以代替抗生素的安全有效的天然生物防腐劑.而乳酸菌細(xì)菌素作為抑菌物質(zhì)摻入食品系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛研究，且其在食品中的安全性和有效性已經(jīng)得到反復(fù)驗(yàn)證[12-13].如果可以篩選出一株抑菌性能較好的乳酸菌，將對(duì)天然防腐劑的研發(fā)起到積極作用.因此，本實(shí)驗(yàn)首先篩選對(duì)大腸桿菌抑菌作用較強(qiáng)的乳酸菌，然后研究其抑菌物質(zhì)性質(zhì)以及優(yōu)化抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生條件，為天然生物防腐劑的研究提供一定的理論參考.

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

乳酸菌來(lái)源：從皖南、皖北等地區(qū)自家腌制菜中篩選得到.

大腸桿菌ATCC25922，由學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 設(shè)備及試劑

主要設(shè)備：SHP—250型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）;1-15PK離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）;722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）;phs-25型PH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）.

主要試劑：木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、硫酸鎂、硫酸錳、瓊脂、乙醇、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、乳糖、蔗糖、低聚果糖、低聚半乳糖等化學(xué)試劑，均購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離與純化

從皖南、皖北等地區(qū)獲得的家庭自制腌制菜的汁液中分離乳酸菌菌株.無(wú)菌操作取樣品1mL，用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇合適的梯度，涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)48h.挑取典型菌落，多次劃線后得到純菌株.將得到的純菌株進(jìn)行革蘭氏染色、菌落形態(tài)觀察、接觸酶實(shí)驗(yàn)等系列實(shí)驗(yàn)，確定為乳酸菌后用甘油保藏在-80℃的冰箱里[14].

1.3.2 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法[15].將過(guò)夜培養(yǎng)的乳酸菌菌液接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)20h，再在4℃，12000rpm/min下離心20min，過(guò)濾除菌，得到乳酸菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液.將過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12h，調(diào)節(jié)OD至0.3，菌落數(shù)約在1×108cfu/mL左右.取大腸桿菌菌懸液1mL，與LB固體培養(yǎng)基混合凝固后，將滅過(guò)菌的牛津杯放置在培養(yǎng)皿上.再往牛津杯里添加200μL乳酸菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，將此平板正面靜置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后測(cè)量抑菌圈大小.

1.3.3 乳酸菌抑菌物質(zhì)的性質(zhì)研究

1.3.3.1 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

將過(guò)夜培養(yǎng)的乳酸菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20h，在4℃和12000rpm/min條件下離心20min，過(guò)濾除菌，得到乳酸菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液.將此上清液分別在37℃、60℃、80℃、90℃、100℃的水浴鍋中處理30min，對(duì)照組置于4℃冰箱保存30min，檢測(cè)其抑菌活性[16].

1.3.3.2 抑菌物質(zhì)的pH穩(wěn)定性試驗(yàn)

取等量乳酸菌發(fā)酵上清液6份，調(diào)節(jié)pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，過(guò)濾除菌，然后檢測(cè)其抑菌活性[16].

1.3.3.3 抑菌物質(zhì)的蛋白酶敏感性試驗(yàn)

取等量乳酸菌上清液2份，調(diào)節(jié)pH值分別至兩種酶液的最適pH（胰蛋白酶為7.4、木瓜蛋白酶為6.0），對(duì)照組為原始菌液，再分別加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶處理60min（蛋白酶濃度為1.0mg/mL），調(diào)pH為初始值，過(guò)濾除菌，然后檢測(cè)其抑菌活性[16].

1.3.4 乳酸菌抑菌條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌能力的影響

培養(yǎng)基的初始pH為6.2，碳源為葡萄糖，將接好菌的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)12h、18h、24h、36h、48h.通過(guò)體外抑菌實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間抑菌圈的大小，以此來(lái)確定最佳培養(yǎng)時(shí)間.

1.3.4.2 不同碳源對(duì)抑菌能力的影響

培養(yǎng)基的初始pH為6.2，培養(yǎng)時(shí)間為24h.以葡萄糖、乳糖、蔗糖、低聚果糖、低聚半乳糖分別作為培養(yǎng)基中的唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng).同樣根據(jù)抑菌圈直徑大小來(lái)確定最佳碳源[17-18].

1.3.4.3 培養(yǎng)基初始pH對(duì)抑菌能力的影響

培養(yǎng)時(shí)間為24h，碳源為葡萄糖，取等量的MRS液體培養(yǎng)基5份，初始pH值分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，檢測(cè)抑菌活性，根據(jù)抑菌圈大小選定最合適的初始pH.

1.3.5 乳酸菌抑菌條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素選擇三個(gè)較優(yōu)水平，以抑菌圈大小為指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，最后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行整理分析從而得到最佳的抑菌條件.

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用純培養(yǎng)方法從不同來(lái)源的腌制菜中分離出50株乳酸菌，以大腸桿菌為指示菌，對(duì)其進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1.由表1可知，大多數(shù)乳酸菌對(duì)大腸桿菌都有不同程度的抑制能力.經(jīng)過(guò)綜合評(píng)定選擇菌株7-1為研究對(duì)象，經(jīng)細(xì)菌16S rDNA鑒定為植物乳桿菌.

2.2 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的性質(zhì)研究結(jié)果

2.2.1 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

乳酸菌抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，乳酸菌抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性在研究范圍內(nèi)是比較好的.隨著溫度的增加，出現(xiàn)先緩慢增加后緩慢降低的趨勢(shì).植物乳桿菌7-1可以耐受100℃的高溫，經(jīng)過(guò)高溫處理后，抑菌活性僅降低17.24%.結(jié)果表明，該菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)中起主要作用的不是大分子蛋白質(zhì).

2.2.2 pH對(duì)抑菌效果的影響

pH對(duì)植物乳桿菌7-1抑菌效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖2.由圖2可知，植物乳桿菌7-1的抑菌效果隨pH值的增大呈現(xiàn)先增后顯著降低的趨勢(shì).當(dāng)pH為4時(shí)抑菌活性最大;當(dāng)pH在4-6時(shí)，抑菌活性顯著下降;當(dāng)pH在6-7時(shí)，抑菌活性劇烈下降直至失去活性.結(jié)果表明溶液的酸堿性對(duì)抑菌物質(zhì)的抑菌活性影響很大，在酸性條件下抑菌活性強(qiáng)，在中性及堿性條件下幾乎失去活性，符合細(xì)菌素的性質(zhì).

2.2.3 抑菌物質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性

植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性結(jié)果如圖3所示.結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)蛋白酶酶解之后，此抑菌物質(zhì)的抑菌活性劇烈下降近乎失活，由此結(jié)果可以推斷植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要為多肽類物質(zhì)，而細(xì)菌素正符合這一性質(zhì)[19]，故可以進(jìn)一步判定植物乳桿菌7-1發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素，可以被蛋白酶降解，具有環(huán)境友好型特點(diǎn).

綜合圖1、圖2和圖3結(jié)果可知，植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)初步可以判定為多肽類細(xì)菌素，具有良好的熱穩(wěn)定性，在酸性條件下抑菌活性較大，具有環(huán)境友好型等特點(diǎn).

2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響

抑菌物質(zhì)大多數(shù)是微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，不同的培養(yǎng)時(shí)間會(huì)對(duì)抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量產(chǎn)生影響從而影響抑菌效果.因此，為了探究植物乳桿菌7-1產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)時(shí)間，設(shè)置了培養(yǎng)時(shí)間梯度，結(jié)果如圖4所示.抑菌效果隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后降低，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為24h時(shí)，抑菌效果最好.微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物一般在穩(wěn)定期會(huì)積累，這個(gè)結(jié)果說(shuō)明植物乳桿菌7-1在24h時(shí)結(jié)束穩(wěn)定期進(jìn)入衰亡期，24h后抑菌效果下降可能是因?yàn)樗ネ銎诘奈⑸锱c抑菌物質(zhì)相互作用，影響了其活性.

2.4 不同碳源對(duì)抑菌效果的影響

在微生物的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中，碳源作為重要的營(yíng)養(yǎng)要素之一必不可少.因此，為了探究植物乳桿菌7-1的生長(zhǎng)狀態(tài)達(dá)到最佳時(shí)的碳源，研究了不同碳源對(duì)抑菌效果的影響，結(jié)果如圖5所示，不同的碳源條件下產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的抑菌性能各不相同，其中最好的碳源是低聚果糖，葡萄糖次之，低聚半乳糖最差，結(jié)果表明植物乳桿菌7-1可以更好地利用低聚果糖.

2.5 不同初始pH對(duì)抑菌效果的影響

培養(yǎng)基的酸堿性與微生物的生長(zhǎng)繁殖有很大的關(guān)系，因此，為了探究植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的抑菌活性最大時(shí)的培養(yǎng)基的初始pH，設(shè)置了不同初始pH，結(jié)果如圖6所示.結(jié)果表明，植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的抑菌活性隨著初始pH的遞增呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)pH為7時(shí)抑菌活性最大.當(dāng)pH在6-7范圍內(nèi)時(shí)抑菌性變化不明顯，而當(dāng)培養(yǎng)基初始pH呈堿性時(shí)抑菌活性開(kāi)始顯著降低.通過(guò)這一結(jié)果可以進(jìn)一步推斷植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)應(yīng)該是細(xì)菌素，由于培養(yǎng)基的堿性條件抑制或影響了細(xì)菌素的活性從而導(dǎo)致抑菌活性降低.

2.6 抑菌條件正交優(yōu)化結(jié)果

以A（培養(yǎng)時(shí)間）、B（不同碳源）、C（初始pH）3因素，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，通過(guò)抑菌圈大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)抑菌條件進(jìn)行優(yōu)化從而得到最佳的抑菌條件.其正交因素水平表如表2所示，結(jié)果分析見(jiàn)表3.

由表3可知，影響植物乳桿菌7-1抑菌活性的三個(gè)因素的主次順序依次為A（培養(yǎng)時(shí)間）>B（不同碳源）>C（初始pH），即培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌活性影響最大，其次為不同碳源的培養(yǎng)基，影響最小的是培養(yǎng)基的初始pH.根據(jù)極差分析可知，得到最大的抑菌活性對(duì)應(yīng)的最優(yōu)抑菌條件的組合為A3B1C3，即培養(yǎng)時(shí)間為36h、碳源為葡萄糖、初始pH為7.通過(guò)結(jié)果可知在這種組合下植物乳桿菌7-1的抑菌圈大小為19.6mm.

3 結(jié)論

本研究首先從不同來(lái)源的腌制菜中分離純化出50株乳酸菌，然后根據(jù)體外抑菌實(shí)驗(yàn)從中篩選出一株抑菌效果最佳的植物乳桿菌7-1.對(duì)植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)其可以耐受100℃的高溫，在酸性條件下抑菌活性較大，可以被蛋白酶降解失去抑菌活性，初步判斷該菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要為細(xì)菌素.抑菌條件優(yōu)化的結(jié)果表明植物乳桿菌7-1的培養(yǎng)時(shí)間為36h、碳源為葡萄糖、培養(yǎng)基初始pH為7時(shí)可以得到最佳的抑菌活性.通過(guò)對(duì)植物乳桿菌7-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行研究以及抑菌條件優(yōu)化，豐富了天然生物防腐劑研究文庫(kù)，為今后天然生物防腐劑的研究提供了一份參考.

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