過表達miRNA-224骨髓間充質(zhì)干細胞對卵巢顆粒細胞增殖和氧化應激的影響*

蔣 來，陳 玲，彭 影，公顏平，張秀云

中國科學技術(shù)大學附屬第一醫(yī)院(合肥230001)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指女性因卵巢功能衰竭而出現(xiàn)閉經(jīng)的現(xiàn)象，多發(fā)生于40歲之前。POF是育齡期女性常見的生殖系統(tǒng)疾病，其臨床表現(xiàn)包括閉經(jīng)、不孕和性欲下降等。近年來，隨著社會發(fā)展和生活節(jié)奏的加快，POF的發(fā)病率逐漸升高，且日趨低齡化，嚴重影響我國女性生殖健康[1-2]。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是從骨髓中分離出的多功能干細胞，具有自我修復和多向分化潛能，是組織工程領(lǐng)域常用的種子細胞[3]。研究表明，BMSCs可通過保護原始卵泡、抑制卵巢顆粒細胞的凋亡部分改善卵巢功能，但其療效仍需進一步提高[4]。微小RNA(miRNA)廣泛存在于真核生物細胞內(nèi)，是一類由18～22個核苷酸組成的非編碼RNA。miRNA在細胞的生長、發(fā)育、分化和衰老等過程發(fā)揮重要的作用。miRNA與生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中，miRNA-224是較早在生殖系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的miRNA。高冬梅等[5]發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，宮頸癌組織中miRNA-224的表達水平顯著升高，且miRNA-224可作為宮頸癌臨床診斷和評估預后的標記物。Zhang等[6]也證實，miRNA-224在卵巢中表達，且上調(diào)miRNA-224可促進卵巢顆粒細胞的增殖，抑制顆粒細胞的凋亡。但鮮有報道研究miRNA-224在卵巢早衰中的作用及其機制。本研究首先構(gòu)建miRNA-224轉(zhuǎn)染的BMSCs，繼而將BMSCs與卵巢顆粒細胞共培養(yǎng)，觀察過表達miRNA-224的BMSCs對卵巢顆粒細胞增殖和氧化應激的影響，以期為POF的治療提供新的靶點及理論依據(jù)。

材料與方法

1 實驗材料 Wistar大鼠購自南京模式動物研究所；過表達miRNA-224慢病毒LV-miRNA-224及對照慢病毒LV-GFP由上海吉凱基因工程技術(shù)有限公司構(gòu)建和鑒定；順鉑購自美國 Sigma 公司；DMEM培養(yǎng)基均購自美國 Gibco 公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒、丙二醛(MDA)和細胞內(nèi)活性氧(ROS)檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 BMSCs的分離、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將Wistar大鼠麻醉，置于無菌操作臺上，取出脛骨和股骨，用預冷的DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集沖洗液后重懸細胞。將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37℃條件下培養(yǎng)。利用貼壁法篩選出純度較高的BMSCs。待細胞貼壁且生長穩(wěn)定后，胰蛋白酶消化重懸細胞，以CD34、CD44、CD45和CD105抗體標記所提取的原代BMSCs，以流式細胞術(shù)檢測原代BMSCs中CD34、CD44、CD45和CD105的表達情況，證明其為 BMSCs。隨后將提取的原代BMSCs接種于三個培養(yǎng)皿中，將細胞分為三組。其中空白組：未做任何處理的原代BMSCs細胞；BMSCs組：轉(zhuǎn)染LV-GFP的原代BMSCs細胞；miRNA-224+BMSCs組：轉(zhuǎn)染過表達慢病毒LV-miRNA-224的原代BMSCs細胞，并用于以下實驗。

3 qRT-PCR法檢測空白組、BMSCs組、miR-224+BMSCs組miRNA-224的表達 移除上清液，提取細胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴增后以U6作為參照物，檢測miRNA-224 mRNA的表達。miRNA-224上游引物序列為 5’- GTAGAAGTCTAACTGGAAAAC-3’，下游引物序列為5’- CATGTCATCATCAACACCACTG-3’。U6上游引物序列為 5’-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3’，下游引物序列為5’- TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3’。

4 卵巢顆粒細胞的分離和培養(yǎng) 取21～24 d雌性Wistar大鼠，皮下注射孕馬血清促性腺激素,無菌條件下將卵巢取出。注射器刺破卵巢，吸出顆粒細胞，將重懸后的細胞接種于96孔板中，37℃條件下培養(yǎng)。將轉(zhuǎn)染后的BMSCs與卵巢顆粒細胞共培養(yǎng)24 h，按200 μl/孔加入順鉑(濃度為2.5 μg/ml)。將細胞分為六組：①對照組為未做處理的BMSCs原代細胞與卵巢顆粒細胞共培養(yǎng)組；②BMSCs共培養(yǎng)組：將轉(zhuǎn)染LV-GFP的原代BMSCs細胞與顆粒細胞共培養(yǎng)；③miRNA-224+BMSCs共培養(yǎng)組：將轉(zhuǎn)染LV-miRNA-224的原代BMSCs細胞與卵巢顆粒細胞進行共培養(yǎng)；④順鉑組：在原代BMSCs細胞與顆粒細胞共培養(yǎng)的同時給予一定濃度的順鉑進行處理；⑤BMSCs+順鉑組：轉(zhuǎn)染LV-GFP的原代BMSCs細胞與顆粒細胞共培養(yǎng)的同時給予一定濃度的順鉑進行處理；⑥miRNA-224+BMSCs+順鉑組：轉(zhuǎn)染LV-miRNA-224的原代BMSCs細胞與卵巢顆粒細胞進行共培養(yǎng)的同時給予一定濃度的順鉑進行處理。

5 卵巢顆粒細胞的鑒定 應用免疫組化法鑒定卵巢顆粒細胞，具體操作步驟如下：待細胞貼壁后，加入4%多聚甲醛固定，封閉后滴加卵泡刺激素受體(FSHR)抗體，4℃孵育過夜。加入HRP標記的二抗后室溫下孵育30 min，顯色后蘇木素復染，返藍后脫水封片，顯微鏡下檢查。

6 MTT法檢測細胞存活率 將處理后的細胞接種到 96 孔板，移除上清液，每孔加入5 g/L 的 MTT，孵育后移除上清液，加入二甲基亞砜溶液，孵育10 min。檢測490 nm 波長下各組細胞的吸光度值(OD值)，計算存活率，細胞存活率(%) = 處理組 OD 值/正常組 OD 值×100%。

7 氧化應激水平檢測 移除上清液后，收集活細胞，嚴格按照各試劑盒的步驟操作，檢測各組細胞總丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平。

結(jié) 果

1 miRNA-224的表達 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后miRNA-224表達水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1各組細胞miRNA-224表達水平

注：與空白組相比，*P<0.05

2 卵巢顆粒細胞的鑒定 顯微鏡下觀察可見顆粒細胞呈多角形或短梭形，胞內(nèi)可見顆粒樣物質(zhì)(圖1A)；此外，F(xiàn)SHR免疫組化檢測結(jié)果顯示，顆粒細胞呈棕色(圖1B)，陰性對照的細胞為藍紫色(圖1C)。

圖1 卵巢顆粒細胞的鑒定(免疫組化法，×100)

3 細胞存活率比較 與對照組相比，順鉑組細胞存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05 )；而與順鉑組相比，BMSCs+順鉑組和miRNA-224+BMSCs+順鉑組細胞存活率顯著升高，且相較于BMSCs+順鉑組，miRNA-224+BMSCs+順鉑組細胞存活率進一步升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組、BMSCs組和miRNA-224+BMSCs組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2MTT法檢測各組OD值和細胞存活率

注：與對照組相比，*P<0.05；與順鉑組相比，△P<0.05；與BMSCs+順鉑組相比，▲P<0.05

4 細胞氧化應激水平比較 與對照組相比，順鉑組細胞MDA和ROS水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而與順鉑組相比，BMSCs+順鉑組和miRNA-224-BMSCs+順鉑組細胞MDA和ROS水平顯著降低，且相較于BMSCs+順鉑組，miRNA-224-BMSCs+順鉑組細胞MDA和ROS水平進一步降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組、BMSCs組和miRNA-224-BMSCs組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3各組細胞MDA值和ROS水平

注：與對照組相比,*P<0.05；與順鉑組相比,△P<0.05；與BMSCs+順鉑組相比,▲P<0.05

討 論

近年來，隨著女性腫瘤患者的增加和化療的廣泛開展，化療所致的POF已逐漸成為臨床和基礎研究的焦點。順鉑等化療藥物可導致卵巢組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，包括原始卵泡數(shù)量減少、顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖等，最終引起卵巢組織纖維化和POF[7]。臨床研究表明，育齡期乳腺癌患者接受化療后，將近55%的患者可出現(xiàn)POF[8]。顆粒細胞是卵巢的主要功能細胞，也是雌、孕激素的主要來源，在卵泡生長發(fā)育過程中起著舉足輕重的作用。研究表明,卵巢顆粒細胞的凋亡與卵泡閉鎖和POF的發(fā)生密切相關(guān)，而抑制卵巢顆粒細胞的凋亡可以避免或延緩POF的發(fā)生[9]。

BMSCs是一類具有自我修復和多向分化潛能的干細胞,在維持機體組織形態(tài)和功能的完整性方面發(fā)揮重要的作用。BMSCs在組織工程、基因治療和細胞替代治療等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用,可用于脊髓修復、心肌再生和抗衰老等。Fu等[4]的研究表明，BMSCs移植可抑制卵巢顆粒細胞的凋亡，提高卵巢抗氧化功能，降低化療藥引起的卵巢損傷。Kim等[10]的研究也證實,BMSCs移植可降低化療藥物引起的卵巢顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖,改善卵巢功能。但相關(guān)研究也表明，BMSCs移植并不能完全逆轉(zhuǎn)化療藥引起的卵巢損傷，僅能部分恢復卵巢功能。其中，移植后BMSCs的快速凋亡是療效不佳的主要原因。因此，提高BMSCs的存活率顯得尤為重要[11]。

miRNA-224是較早在生殖系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的miRNA,在卵巢顆粒細胞的增殖和凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[12]。既往文獻報道，過表達miRNA-224可促進卵巢顆粒細胞的增殖，抑制顆粒細胞的凋亡[6]。然而，尚不明確miRNA-224能否增強BMSCs對POF的療效。本研究首先構(gòu)建miRNA-224轉(zhuǎn)染的BMSCs,繼而將miRNA-224-BMSCs與順鉑處理的卵巢顆粒細胞共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，順鉑處理后顆粒細胞的存活率顯著降低，而與BMSCs共培養(yǎng)可提高顆粒細胞的存活率，且過表達miRNA-224的BMSCs可進一步提高顆粒細胞的存活率。提示過表達miRNA-224的BMSCs具有更強的抑制卵巢顆粒細胞凋亡的能力。

順鉑等化療藥物導致POF的具體機制至今仍未完全清楚，其中，氧化應激損傷被認為是最重要的機制之一[13]。MDA和ROS是細胞內(nèi)重要的氧化應激指標，MDA是脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的醛類物質(zhì)，ROS由半醌自由基與氧結(jié)合后形成，兩者均可加重順鉑的細胞毒性[14-16]。本研究結(jié)果表明，順鉑處理的顆粒細胞，其MDA和ROS水平顯著上調(diào)，而BMSCs與顆粒細胞共培養(yǎng)可降低MDA和ROS水平，且過表達miRNA-224的BMSCs可進一步降低MDA和ROS水平，提示miRNA-224通過降低氧化應激水平抑制順鉑誘導的卵巢顆粒細胞凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，過表達miRNA-224的BMSCs可明顯降低順鉑誘導的卵巢顆粒細胞凋亡，其機制與氧化應激密切相關(guān)。本研究為防治POF提供了新的靶點和理論依據(jù)。然而，本研究仍有不足之處：沒有進行在體動物實驗，缺乏體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)。因此，這些不足將是我們接下來研究的重點。