GLYX-13通過NR2B-ERK-CREB信號(hào)通路改善氯胺酮麻醉后幼鼠認(rèn)知功能障礙①

鄭文婧 郄曉娟 鄭文芳

(衡水市人民醫(yī)院麻醉科，衡水 053000)

認(rèn)知功能障礙是手術(shù)患者麻醉后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，氯胺酮在抗焦慮、抗抑郁、小兒麻醉等方面有廣泛的應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性促進(jìn)幼鼠神經(jīng)元變性、壞死和凋亡，可引起幼鼠認(rèn)知功能損害[1，2]。因此探討預(yù)防和治療由氯胺酮麻醉所致的認(rèn)知功能障礙在臨床上具有重要意義。GLYX-13為蘇氨酸-脯氨酸-脯氨酸-蘇氨酸多肽，可與N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體甘氨酸位點(diǎn)結(jié)合，增強(qiáng)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[3，4]，但其作用機(jī)制尚不清楚。NR2B-ERK-CREB信號(hào)通路與大鼠的學(xué)習(xí)、記憶的形成關(guān)系密切[5，6]。本文對GLYX-13對氯胺酮麻醉后幼鼠認(rèn)知功能障礙及海馬組織NR2B-ERK-CREB信號(hào)通路的影響進(jìn)行研究，探討GLYX-13改善氯胺酮麻醉后幼鼠認(rèn)知功能障礙的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康、清潔級(jí)、雌雄各半、3周齡、體質(zhì)量7～10 g、C57BL/6小鼠60只[北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2014-000]。

1.1.2主要試劑 鹽酸氯胺酮注射液(福建古田藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H35020148)，GLYX-13(美國Sigma公司，批號(hào)：015M4731V)，Morris水迷宮、曠場實(shí)驗(yàn)(美國Noldus公司)，BCA法蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液(美國Proteinech Group公司)，兔抗鼠NR2B多克隆抗體、兔抗鼠ERK多克隆抗體、兔抗鼠p-ERK多克隆抗體、兔抗鼠CREB多克隆抗體、兔抗鼠p-CREB多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體、羅丹明熒光標(biāo)記山羊抗兔二抗(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理 將60只幼鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為對照組(NS組)、氯胺酮麻醉組(Ket組)、氯胺酮麻醉+GLYX-13組(Ket+GLYX-13組)，每組20只。Ket組和Ket+GLYX-13組小鼠每天腹腔注射30 mg/kg氯胺酮，間隔30 min重復(fù)一次，每天3次，共5 d[7]；Ket+GLYX-13組小鼠每天首次注射氯胺酮前2 h尾靜脈注射1 mg/kg GLYX-13(參照文獻(xiàn)[4，8]選擇GLYX-13劑量為1 mg/kg)共5 d；NS組小鼠每天注射等量生理鹽水，共5 d。

1.2.2水迷宮實(shí)驗(yàn) 將一高60 cm、直徑120 cm圓形水池中注入清水，水溫維持在22～26℃，將水池分為4個(gè)象限，將平臺(tái)放置在第一個(gè)象限內(nèi)，平臺(tái)頂位于水下1.5 cm。前4 d每天上午10點(diǎn)進(jìn)行定位航行試驗(yàn)：將小鼠按照1至4象限的順序放入水池中，記錄小鼠逃避潛伏期，即1 min內(nèi)找到平臺(tái)所需要的時(shí)間，若小鼠在1 min內(nèi)無法找到平臺(tái)則引導(dǎo)小鼠上平臺(tái)，將其逃避潛伏期記錄為1 min，取4個(gè)象限平均值。第5天上午10點(diǎn)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)：將平臺(tái)從水池中撤除，將小鼠從第3象限放入水池，記錄小鼠在1 min內(nèi)穿越原平臺(tái)象限次數(shù)和在原平臺(tái)象限停留時(shí)間。

1.2.3曠場實(shí)驗(yàn) 每天下午4點(diǎn)進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，正方形的曠場箱底部劃分為25個(gè)大小相等的方格，中間的9個(gè)方格為曠場中心區(qū)，將小鼠放置在曠場箱中央?yún)^(qū)自由活動(dòng)，記錄15 min內(nèi)小鼠在中心區(qū)停留時(shí)間，共測試3 d。

1.2.4Western blot法測定海馬組織NR2B、ERK、p-ERK、CREB、p-CREB蛋白水平 小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取10只小鼠，戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，斷頭取海馬組織，取100 mg海馬組織加入Lysis Buffer裂解液裂解海馬組織，提取海馬組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗：兔抗鼠NR2B多克隆抗體(1∶2 000)、兔抗鼠ERK多克隆抗體(1∶500)、兔抗鼠p-ERK多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗鼠CREB多克隆抗體(1∶5 00)、兔抗鼠p-CREB多克隆抗體(1∶1 000)過夜孵育，以β-actin為內(nèi)參照，加入二抗(1∶3 000)孵育2 h，加入ECL發(fā)光液顯影，采用Quantity One 4.6.2圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值，目標(biāo)蛋白水平以目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.2.5采用免疫熒光法測定海馬CA1區(qū)NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白表達(dá)情況 取各組小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每組剩余的10只小鼠，麻醉后斷頭處死，取小鼠海馬組織在福爾馬林中過夜固定，取出海馬組織塊經(jīng)梯度脫水、透明、浸蠟、包埋，切成5 μm厚切片。將石蠟切片烤片30 min，脫蠟、脫水，加入檸檬酸鹽緩沖液煮沸12 min修復(fù)抗原，加入Tritonx-100通透30 min，加入山羊血清封閉40 min，加入一抗過夜孵育，加入羅丹明熒光標(biāo)記二抗孵育1 h，加入DAPI封片，鏡下觀察熒光染色情況，采用Image-Pro plus圖像分析軟件分析陽性熒光信號(hào)強(qiáng)度，二抗標(biāo)記的免疫陽性細(xì)胞呈紅色。陽性對照標(biāo)本：一抗(NR2B、p-ERK、p-CREB)滴加海馬組織切片，之后加羅丹明熒光標(biāo)記二抗；陰性對照標(biāo)本：PBS代替一抗滴加組織切片。

2 結(jié)果

2.1三組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 與NS組比較，Ket組和Ket+GLYX-13組小鼠逃避潛伏期延長(P<0.05)，穿越原平臺(tái)象限次數(shù)和在原平臺(tái)象限停留時(shí)間降低(P<0.05)；與Ket組比較，Ket+GLYX-13組小鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)，穿越原平臺(tái)象限次數(shù)和在原平臺(tái)象限停留時(shí)間升高(P<0.05)，見表1。

2.2三組小鼠曠場實(shí)驗(yàn)中心區(qū)停留時(shí)間比較 與NS組比較，Ket組和Ket+GLYX-13組小鼠3 d中心區(qū)停留時(shí)間均縮短(P<0.05)；與Ket組比較，Ket+GLYX-13組小鼠3 d中心區(qū)停留時(shí)間均延長(P<0.05)，見表2。

2.3三組小鼠海馬組織NR2B、ERK、p-ERK、CREB、p-CREB蛋白水平比較 三組小鼠海馬組織ERK、CREB蛋白水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；三組小鼠海馬組織NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：與NS組比較，Ket組和Ket+GLYX-13組小鼠海馬組織NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平降低(P<0.05)；與Ket組比較，Ket+GLYX-13組小鼠海馬組織NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平升高(P<0.05)，見表3和圖1。

2.4三組小鼠海馬CA1區(qū)NR2B、 p-ERK、 p-CREB熒光陽性信號(hào)強(qiáng)度比較 與NS組比較，Ket組和Ket+GLYX-13組小鼠海馬CA1區(qū)NR2B、p-ERK、p-CREB熒光陽性信號(hào)強(qiáng)度降低(P<0.05)；與Ket組比較，Ket+GLYX-13組小鼠海馬CA1區(qū)NR2B、p-ERK、p-CREB熒光陽性信號(hào)強(qiáng)度升高(P<0.05)，見表4和圖2。

GroupsnEscape latency(s)Day 1Day 2Day 3Day 4Number of quadrants crossingthe original platform(times)In the original platformquadrant residence time(s)NS group2055.24±6.1342.13±4.7622.14±2.9816.47±1.898.69±1.2417.68±2.13Ket group2068.25±6.371)53.24±5.171)33.27±3.121)23.16±2.141)3.15±1.031)9.24±1.171)Ket+GLYX-13 group2060.14±5.821)2)48.71±5.691)2)27.39±2.911)2)19.32±1.781)2)6.26±1.211)2)14.35±1.091)2)F23.12322.90268.68359.738113.889152.856P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the NS group,1)P<0.05;compared with the Ket group,2)P<0.05.

GroupsnResidence time in the central area(s)Day 1Day 2Day 3NS group2057.32±5.3656.47±5.2557.86±4.79Ket group2025.15±4.981)26.71±4.871)26.34±4.851)Ket+GLYX-13 group2049.72±5.131)2)48.58±5.221)2)49.12±5.211)2)F212.451181.618215.842P<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the NS group,1)P<0.05;compared with the Ket group,2)P<0.05.

GroupsnNR2BERKp-ERKCREBp-CREBNS group100.37±0.080.72±0.130.39±0.070.84±0.150.64±0.13Ket group100.09±0.041)0.69±0.120.11±0.031)0.83±0.140.18±0.071)Ket+GLYX-13 group100.18±0.051)2)0.71±0.140.21±0.061)2)0.85±0.130.43±0.101)2)F58.3810.13864.2550.05150.031P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the NS group,1)P<0.05;compared with the Ket group,2)P<0.05.

GroupsnNR2B fluorescencepositive signal intensityp-ERK fluorescencepositive signal intensityp-CREB fluorescencepositive signal intensityNS group100.042±0.0090.034±0.0080.051±0.007Ket group100.016±0.0071)0.013±0.0051)0.010±0.0051)Ket+GLYX-13 group100.027±0.0081)2)0.022±0.0071)2)0.024±0.0091)2)F26.34024.13084.065P<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the NS group,1)P<0.05;compared with the Ket group,2)P<0.05.

圖1 三組小鼠海馬組織NR2B、ERK、p-ERK、CREB、p-CREB蛋白Western blot電泳圖Fig.1 Western blot analysis of NR2B,ERK,p-ERK,CREB and p-CREB proteins in hippocampus of three groups of miceNote:A.NS group；B.Ket group；C.Ket+GLYX-13.

圖2 免疫熒光法測定三組小鼠海馬CA1區(qū)NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白表達(dá)(×200)Fig.2 Immunofluorescence assay for NR2B,p-ERK,and p-CREB protein expression in hippocampal CA1 region of three groups of mice(×200)

3 討論

氯胺酮鎮(zhèn)痛效果好，無明顯呼吸抑制作用，在小兒全身麻醉和基礎(chǔ)麻醉中應(yīng)用廣泛[9]。但近來研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮可對大腦產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[10]。氯胺酮可通過誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡等方式對腦組織造成損害，影響近期和遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙[11,12]。因此在麻醉過程中聯(lián)合其他藥物或其他腦保護(hù)手段可減輕氯胺酮對神經(jīng)元的毒性作用，減輕腦組織損傷，減少氯胺酮對認(rèn)知功能的損傷，提高麻醉安全性。

興奮性氨基酸(谷氨酸)在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，是一種生理興奮性遞質(zhì)，對突觸功能及可塑性具有重要作用，NMDA受體由多個(gè)受體亞單位組成的一種異五聚體，對鈣離子有高通透性[13，14]。在正常情況下，鈣離子通道被鎂離子電壓阻斷，當(dāng)大量谷氨酸和NMDA受體亞基NR2B高親和性結(jié)合時(shí)，可以置換出離子通道中的鎂離子，激活NMDA受體對鈣離子的高通透性，從而產(chǎn)生興奮毒性[15]。ERK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)亞家族成員，當(dāng)上游的ERK激酶受到突觸內(nèi)NMDA受體鈣離子通道鈣內(nèi)流的刺激時(shí)，ERK可發(fā)生磷酸化，磷酸化的ERK(p-ERK)核轉(zhuǎn)位，并磷酸化下游的CREB，CREB為促存活轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化的CREB(p-CREB)可通過調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等基因的表達(dá)，減少神經(jīng)元的凋亡[16,17]。海馬組織缺乏NR2B可引起學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙，高表達(dá)NR2B可通過ERK信號(hào)通路參與海馬學(xué)習(xí)記憶的鞏固，ERK可激活CREB，磷酸化的CREB參與海馬記憶的形成，從而提高認(rèn)知功能[18,19]。

NMDA受體是麻醉藥物作用的關(guān)鍵部位，麻醉藥物和NMDA受體結(jié)合可拮抗NMDA受體的作用，引起神經(jīng)元變性壞死，抑制神經(jīng)營養(yǎng)谷氨酸供給大腦，影響大腦功能。GLYX-13可作用于含NR2B的NMDA受體甘氨酸位點(diǎn)，提高NR2B亞基蛋白的表達(dá)水平，增強(qiáng)海馬的學(xué)習(xí)記憶能力。GLYX-13可促進(jìn)海馬CA1區(qū)突觸傳遞，可增加突觸傳遞過程的長時(shí)程增強(qiáng)幅度，減少長時(shí)程抑制的發(fā)生[20,21]。

本研究發(fā)現(xiàn)：氯胺酮可延長小鼠逃避潛伏期，降低穿越原平臺(tái)象限次數(shù)并在原平臺(tái)象限停留時(shí)間和中心區(qū)停留時(shí)間均縮短，降低海馬組織NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平且海馬CA1區(qū)NR2B、p-ERK、p-CREB熒光陽性信號(hào)強(qiáng)度。表明氯胺酮可引起幼鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能為氯胺酮和NMDA受體NR2B亞基結(jié)合，降低NR2B水平，NR2B表達(dá)水平降低抑制ERK磷酸化，從而抑制CREB磷酸化，損害海馬組織的認(rèn)知功能。氯胺酮麻醉幼鼠給予GLYX-13處理可縮短小鼠逃避潛伏期，延長穿越原平臺(tái)象限次數(shù)、在原平臺(tái)象限停留時(shí)間和中心區(qū)停留時(shí)間，提高海馬組織NR2B、p-ERK、p-CREB蛋白水平且海馬CA1區(qū)NR2B、p-ERK、p-CREB熒光陽性信號(hào)強(qiáng)度升高。表明GLYX-13可能通過作用于含NR2B的NMDA受體甘氨酸位點(diǎn)，提高NR2B亞基蛋白的表達(dá)水平，通過激活ERK和CREB增加海馬的認(rèn)知能力。

綜上所述，氯胺酮可引起幼鼠認(rèn)知功能障礙，GLYX-13可能通過激活NR2B/ERK/CREB信號(hào)通路發(fā)揮中樞神經(jīng)保護(hù)作用，改善氯胺酮引起的幼鼠認(rèn)知功能障礙。