蓽茇酰胺逆轉人小細胞肺癌H446/DDP細胞耐藥性及機制的研究①

肖 娟 張華果 陳 潔 牛朝霞 楊紅梅

(河南醫學高等專科學校，鄭州 451191)

肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，肺癌的發病率和死亡率一直位居惡性腫瘤譜第一位[1]。小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)約占肺癌發生率的20%，由于惡性程度高、侵襲性強、易轉移、多數SCLC患者在確診時已為晚期，失去了手術治療的最佳時機，因此放療和化療成為主要的治療手段。盡管大多數SCLC患者對初始化療較敏感，但極易產生化療耐藥性，導致治療失敗[2]。因此，逆轉化療耐藥性成為目前SCLC治療中亟待解決的問題之一。蓽茇酰胺(piperlongu-mine,PLM)，又名蓽茇明堿，是分離自蓽茇的一種生物堿類化合物。近年研究表明，PLM對前列腺癌、結腸癌、肺腺癌、肝癌和黑色素瘤等惡性腫瘤具有顯著的抑制作用[3-7]。Wang等[8]研究證實，PLM可逆轉人視網膜母細胞瘤耐藥株對長春新堿和卡鉑的耐藥性。但目前國內外尚未見PLM對SCLC順鉑(cisplatin,DDP)耐藥性逆轉作用的報道。本研究擬通過分子生物學方法探究PLM對人SCLC耐藥株H446/DDP細胞的逆轉作用及其分子機制。本研究有望為PLM治療SCLC奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料 人小細胞肺癌H446細胞購自中國科學院昆明細胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和RPMI1640培養基購自Hyclone公司；PLM和DDP購自美國Selleck公司；CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物公司；AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液和ECL化學發光試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；兔抗人P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多藥耐藥相關蛋白1(multidrug resistance associated protein 1,MRP1)、谷胱甘肽S轉移酶P1(glutathione S transferase P1,GSTP1)、Survivin、細胞周期蛋白A(cyclin A)、細胞周期依賴性蛋白激酶2(cyclin dependent kinase 1,CDK1)和β-actin單克隆抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 A549細胞用含10%FBS的RPMI1640培養液培養，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱內；每2 d換液1次，待細胞覆蓋率達到80%時進行傳代。

1.2.2建立耐藥株H446/DDP細胞 取對數生長期的H446細胞，加入含0.1 mg/L DDP的培養液，培養48 h后，更換為不含DDP的培養液繼續培養，待細胞恢復生長后重復上述處理，若細胞能在該濃度下穩定生長，則逐步提高DDP濃度，每次提高約50%，直至細胞可在含有1 mg/L DDP的培養液中穩定生長，將此耐藥細胞株命名為H446/DDP。

1.2.3細胞活力檢測與藥物聯合效用評價 將H446細胞和H446/DDP細胞以每孔5 000個接種于96孔板，常規培養24 h，分別加入不同劑量PLM和DDP，同時設空白組和對照組，每組設5個復孔，孵育24 h；每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育1 h，用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔吸光度A值；計算細胞活力(cell viability)，細胞活力=(加藥組A值-調零組A值)/(對照組A值-調零組A值)×100%；使用SPSS16.0軟件計算藥物的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)，并計算出耐藥倍數與逆轉倍數，耐藥倍數=耐藥細胞IC50/敏感細胞IC50，逆轉倍數=耐藥細胞IC50/PLM作用下IC50；使用CompuSyn軟件計算出在不同抑制效應(fraction affected,Fa)下的藥物聯合指數(combination index,CI)，并繪制出Fa-CI曲線。

1.2.4細胞凋亡檢測 取對數生長期H446/DDP細胞，將其分為對照組、DDP組、PLM組和DDP+PLM組，其中DDP和PLM的終濃度分別為6 mg/L和2 mg/L；藥物處理24 h后，收集各組細胞，PBS洗滌2次，用結合緩沖液重懸細胞，調整細胞密度至5×105個/ml，取200 μl細胞懸液，加入5 μl AnnexinV-FITC和10 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液，輕輕混勻，4℃避光孵育15 min，送流式細胞儀分析檢測。

1.2.5細胞周期檢測 細胞分組同1.2.4段，收集各組細胞，PBS洗滌2次，加入1 ml 冰預冷的75%乙醇，-20℃固定2 h，PBS洗滌2次，加入PI染色液，室溫避光孵育15 min，使用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.6Western印跡法檢測蛋白水平 用不同劑量 PLM(0、2、4 mg/L)處理H446/DDP細胞24 h后，收集各組細胞，加入RIPA裂解液，冰上孵育15 min，4℃下12 000 g離心30 min后取上清，用紫外分光光度法檢測樣品蛋白濃度，取25 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳并轉印到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜2次，加入一抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶2 000 稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進行曝光反應，顯影，拍照，使用ImageJ 1.45s軟件分析目標蛋白的相對灰度值。

2 結果

2.1耐藥前后相關蛋白表達水平的變化 如圖1所示，與親代H446細胞相比，耐藥株H446/DDP細胞中P-gp、MRP1、GSTP1和Survivin蛋白的表達水平均顯著升高(P<0.05)。這提示H446細胞順鉑耐藥性的產生可能與P-gp、MRP1、GSTP1和Survivin蛋白的高表達有關。

2.2PLM與DDP對細胞活力的影響 如圖2所示，與對照組相比，經不同劑量PLM和DDP處理24 h 后， H446和H446/DDP細胞活力均顯著下降(P<0.05)，且隨藥物劑量的增加呈下降趨勢；DDP對H446和H446/DDP細胞的IC50分別為1.21 mg/L和13.76 mg/L，PLM對H446/DDP細胞的IC50為6.29 mg/L；當PLM與DDP按1∶3濃度比聯用時，IC50為7.28 mg/L(其中DDP的濃度為5.46 mg/L)；H446/DDP細胞的耐藥倍數為11.37， PLM對H446/DDP細胞的逆轉倍數為2.52。這表明PLM可增強DDP對H446/DDP細胞的抑制作用。

圖1 H446和H446/DDP細胞中P-gp、MRP1、GSTP1和Survivin蛋白的表達Fig.1 Protein levels of P-gp,MRP1,GSTP1 and Survivin in H446 and H446/DDP cellsNote:A.Western blot analysis;B.Statistical analysis;*.P<0.05 versus H446 group.

圖2 PLM與DDP對H446和H446/DDP細胞活力的影響Fig.2 Effect of PLM and DDP on cell viability in H446 and H446/DDP cellsNote:A.H446 cells;B.H446/DDP cells.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus the same concentration DDP group.

2.3PLM與DDP聯合效應分析 Chou-Talalay中效分析法結果顯示，在不同抑制效應Fa值下，聯合指數CI值均小于1，這說明PLM與DDP聯用可產生協同效應，見圖3。

2.4PLM與DDP對細胞凋亡的影響 如圖4所示，與對照組相比，PLM組、DDP組和DDP+PLM組細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)；同時，DDP+PLM組細胞凋亡率顯著高于DDP組(P<0.05)。這表明PLM可協同增強DDP誘導的H446/DDP細胞凋亡。

圖3 抑制效應-聯合指數曲線Fig.3 Graph of fraction affected(Fa)and combination index(CI)

圖4 PLM和DDP對H446/DDP細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of PLM and DDP on apoptosis of H446/DDP cellsNote:A.Apoptosis detection;B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus DDP group.

圖5 PLM和DDP對H446/DDP細胞周期的影響Fig.5 Effect of PLM and DDP on cell cycle of H446/DDP cellsNote:A.Cell cycle detection;B.Statistica analys.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus DDP group.

圖6 PLM對H446/DDP細胞耐藥相關蛋白表達的影響Fig.6 Effect of PLM on expression levels of resistance-related proteins in H446/DDP cellsNote:A.Western blot analysis;B.Statistica analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus 2 mg/L group.

2.5PLM與DDP對細胞周期的影響 如圖5所示，與對照組相比，PLM組、DDP組和DDP+PLM組細胞G0/G1期細胞比例顯著降低(P<0.05)，S期細胞比例顯著升高(P<0.05)；與DDP組相比，DDP+PLM組G0/G1期細胞比例明顯降低(P<0.05)，S期細胞比例顯著升高(P<0.05)。這表明DDP和PLM可誘導H446/DDP細胞發生S期阻滯，且二者聯用效應更強。

2.6PLM對相關蛋白表達水平的影響 如圖6所示，與對照組相比，經2 mg/L或4 mg/L PLM處理24 h后， H446/DDP細胞中P-gp、MRP1、GSTP1、Survivin、Cyclin A和CDK2蛋白表達水平均顯著下降(P<0.05)，且隨PLM劑量的增加呈下降趨勢。

3 討論

化療是治療中晚期惡性腫瘤患者的重要手段之一，然而耐藥性的產生嚴重制約了化療的效果，甚至導致化療失敗。肺癌化療耐藥性的形成是一個多因素參與的復雜過程，涉及細胞內化療藥物的代謝與積累，以及抗凋亡能力等方面。下調P-gp和MRP1蛋白表達可抑制肺癌細胞對DDP的外排作用，從而逆轉肺癌細胞對DDP的耐藥性[9,10]。而上調GSTP1和Survivin蛋白表達可減弱DDP對肺癌細胞的殺傷作用[11,12]。本研究結果顯示，耐藥株H446/DDP細胞對DDP的耐藥倍數為11.37，其P-gp、MRP1、GSTP1和Survivin蛋白表達水平也均顯著高于親代H446細胞。這表明上述蛋白可能在H446細胞獲得DDP耐藥性的過程中發揮著重要作用。

PLM是一種提取自胡椒科植物蓽茇的生物堿類化合物，具有抗血小板凝集、抗阿爾茲海默病、抗血小板聚集、抗炎、抗抑郁和鎮痛等藥理學作用[13-16]。近年來PLM的抗腫瘤作用逐漸成為研究的熱點。PLM可通過引發氧化應激誘導黑色素瘤細胞凋亡[3]，也可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制結腸癌細胞增殖[4]，還可通過下調P-gp、MRP1和ABCG2蛋白表達逆轉人視網膜母細胞瘤耐藥株HXO-RB44/VCR和SO-Rb50/CBP細胞耐藥性[8]。本研究結果表明，PLM可協同增強DDP對H446/DDP細胞的殺傷作用，逆轉倍數為2.52。

腫瘤細胞可通過ATP 結合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉運蛋白將化療藥物外排至細胞外，使腫瘤細胞內化療藥物含量降低，最終導致多藥耐藥性。P-gp和MDR1為ABC轉運蛋白家族的重要成員。Fang等[10]研究顯示，抑制STAT3活化可下調肺癌耐藥株A549/DDP細胞中MDR1和MRP1基因表達，進而逆轉其耐藥性。吳秋歌等[17]研究證實，抑制P-gp表達可提高H446細胞對DDP的敏感性。Zhao等[18]研究顯示，SCLC耐藥株H69/DDP細胞中MDR1蛋白表達顯著升高。本研究結果表明，PLM可劑量依賴性地下調H446/DDP細胞中P-gp和MRP1的蛋白表達水平，這可能是PLM逆轉H446/DDP細胞耐藥性的機制之一。

GSTP1可催化谷胱甘肽與DDP的結合反應，使后者無法進入細胞核與靶點DNA結合，從而降低腫瘤細胞對DDP的敏感性[19]。Survivin為目前發現的作用最強的凋亡抑制因子，在肺癌細胞DDP耐藥性的形成過程中發揮著重要作用[11]。Wu等[20]研究顯示，下調GSTP1蛋白表達可增強H446/DDP對DDP的敏感性。Tang等[11]研究證實，H446/DDP細胞中Survivin蛋白呈高表達，抑制PI3K/Akt1通路可下調Survivin蛋白，繼而逆轉其DDP耐藥性。本研究表明，PLM可劑量依賴性地下調H446/DDP細胞中GSTP1和Survivin的蛋白表達水平。

Song等[3]研究證實，PLM可上調人黑色素瘤A375和A875細胞中p21和p27蛋白表達，導致其發生G2/M期阻滯。Wang等[8]研究顯示，PLM可通過下調CDK1蛋白表達阻滯人視網膜母細胞瘤細胞于G0/G1期和G2/M期。而下調Cyclin A和CDK2表達會使腫瘤細胞阻滯于S期，從而引起腫瘤細胞凋亡[21,22]。本研究證實，PLM可劑量依賴性地下調Cyclin A和CDK2蛋白表達，并與DDP協同阻滯H446/DDP細胞于S期。

綜上所述，PLM可在體外逆轉人小細胞肺癌耐藥株H446/DDP細胞耐藥性，這可能與其下調P-gp、MRP1、GSTP1、Survivin、Cyclin A和CDK2蛋白表達水平，進而增強DDP誘導的細胞凋亡和S期阻滯有關。