類風濕關節炎患者血清中IL-17表達及IL-17F基因位點rs763780多態性分析

鄧燕群 劉翠玉 尹志華 張允奇 羅秀霞

(深圳市福田區風濕病專科醫院檢驗科，深圳 518040)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是風濕性疾病中最為常見的一種疾病，至今病因未明，目前大部分研究機構認為，RA是由遺傳和環境因素相互作用所致的，其中約50%的RA發病與遺傳基因易感性有關[1，2]。RA是一種有遺傳傾向的多基因疾病，具有復雜的遺傳背景。國內外已有很多RA基因多態性分析研究報道，但仍未找到特異性基因，且不同地區、不同人群SNP的基因多態性分布因遺傳背景和生活環境因素的不同而存在很大差異性[3，4]，同時還有研究表示，一些基因位點多態性與RA自身抗體、細胞因子及炎性物質的產生也存在一定相關性[5，6]。因此，探索RA相關易感基因多態性及自身抗體、細胞因子及炎性物質對RA發病機制的闡明、診斷、治療及研發基因治療靶點藥物具有重要臨床意義。為此，本文對深圳地區RA患者的IL-17F基因位點rs763780單核苷酸多態性及細胞因子、自身抗體和炎癥性物質進行調查研究分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 收集2016年1月～2018年10月來深圳市福田區風濕病專科醫院就診的RA患者176例，其中男81例，女95例，年齡31～52歲，平均(40.62±10.25)歲，均符合2009年美國風濕病協會修訂的RA診斷標準[1]，且3個月內未接受免疫抑制劑及激素類藥物治療。并選取同期來院體檢的健康人群110例，其中男48例，女62例，年齡(30～53)歲，平均(41.63±11.05)歲。排除標準：①合并其他自身免疫性疾病；②孕產婦及哺乳期的婦女；③心功能不全及肝腎功能障礙者；④合并糖尿病、高血壓、急性感染及惡性腫瘤等疾病患者。確保兩組的年齡和性別等一般性資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者均簽署了自愿協議書，并經醫院倫理委員會批準同意。

1.1.2儀器與試劑 全血DNA基因組提取試劑盒由深圳亞能生物技術有限公司提供；CFX-96 PCR儀由美國Bio-Rad公司提供；紫外可見凝膠成像系統、核酸分析儀由德國Eppendorf公司提供；HSP92II限制性內切酶由美國Fermentas公司提供；去核酸酶水、PreMix Taq DNA聚合酶由美國Promega公司提供；瓊脂糖凝膠由西班牙Biowest公司提供；IL-17試劑盒由美國Rapidbio公司提供；DXC600全自動生化分析儀由美國Bankman公司提供。

1.2方法

1.2.1標本采集 所有研究對象采集靜脈血5～6 ml，其中2 ml加入EDTA-K2抗凝管內混勻用于全血DNA提取用；剩余的血加入一次性無抗凝劑干燥管內，用于IL-17、RF及CRP檢測用，均及時送檢。

1.2.2IL-17、RF及CRP檢測 IL-17含量采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測，RF和CRP采用免疫比濁法檢測，所有操作均嚴格按照儀器和試劑盒說明書進行。

1.2.3DNA提取 全血DNA基因組提取采用深圳亞能生物技術有限公司提供的試劑盒進行提取，操作按試劑盒說明書進行，DNA提取完成后通過電泳檢測其是否完整，并采用紫外分光光度儀檢測其濃度以及純度，合格后置于-70℃保存備用。

1.2.4IL-17F基因位點rs763780多態性分析 ①引物設計：引物利用Primer Premier 5軟件設計，引物為F：5′-GGGAATGCAAACAAACACCTGAA-3′，R：5′-CCGTTCCCATCCAGCAAGAGA-3′;②PCR反應體系：總體積6.4 μl，其中DNA模版1 μl、10 μmol/L的上下游引物各0.2 μl、去核酸酶水2 μl、PreMix Taq DNA聚合酶3 μl；③PCR擴增條件為：95℃預變性5 min→95℃變性30 s→60℃30 s→72℃延伸30 s，反復循環36次→72℃延伸5 min；④電泳：于5 μl 的PCR擴增產物中加入2 μl限制性內切酶，37℃孵育6 h以上，于酶切后的PCR產物中加入3%的瓊脂糖凝膠，經Goldview染色，置于250 V電壓下進行電泳，然后利用Bio-Rad凝膠成像儀檢測分型結果。

2 結果

2.1兩組Hardy-Weinberg遺傳平衡分析 經χ2檢驗，RA組和對照組IL-17F基因位點rs763780位點實際基因型分布與Hardy-Weinberg平衡狀態下的理論分布差異無統計學意義(χ2=1.290 3，P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，達到遺傳平衡，具有群體代表性。

2.2兩組血清中IL-17、RF及CRP含量比較 RA組血清中IL-17、RF及CRP含量分別為(36.73±11.06)pg/ml，(58.05±14.92)U/ml和(32.15±13.96)mg/L，明顯高于對照組的(14.52±6.35)pg/ml，(10.24±5.32)U/ml和(6.81±3.25)mg/L，差異均有統計學意義(t=3.035 7～5.320 6，P<0.05)。

2.3兩組IL-17F基因位點rs763780基因型及等位基因頻率比較 RA組CC基因型和C等位基因檢出率分別為19.32%和41.48%，明顯高于對照組的6.36%和26.82%，差異有統計學意義(χ2=3.916 5～5.054 7，P<0.05)，結果見表1。

表2 RA組基因型血清中IL-17，RF及CRP含量比較

Tab.2 Comparison of IL-17,RF and CRP in genotype serum of RA group

ItemCC genotypeCT genotypeTT genotypetPIL-17(pg/ml)42.96±13.6430.25±10.7426.07±9.522.7163-3.5750<0.05RF(U/ml)57.02±13.0356.58±12.3959.85±15.760.6815-0.9371>0.05CRP(mg/L)35.19±14.3232.53±12.8729.74±11.300.8573-1.1203>0.05

表1 RA組與對照組IL-17F基因位點rs763780基因型及等位基因頻率比較[n(%)]

Tab.1 Comparison of rs763780 genotype and allele frequency of IL-17F locus in RA group and control group[n(%)]

GroupsnGenotype frequencyCCCTTTAllele frequencyCTRA17634(19.32)78(44.32)64(36.36)146(41.48)206(58.52)Control1107( 6.36)45(40.91)58(52.73)59(26.82)161(73.18)

圖1 IL-17F基因位點rs763780擴增產物電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of rs763780 amplification product of IL-17F gene locusNote:M.Marker;1 and 2.CT genotypes; 3,6 and 8 .TT genotypes; 4,5,and 7.CC genotypes.

2.4電泳結果 PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，IL-17F基因位點rs763780分別于407、290及117 bp處顯色檢出TT、CT及CC三種基因型，結果見圖1。

2.5RA組基因型血清中IL-17、RF及CRP含量比較 RA組IL-17F基因位點rs763780 CC基因型中的IL-17水平為(42.96±13.64)pg/ml，明顯高于其他基因型，差異有統計學意義(P<0.05)，而三種基因型血清中RF和CRP水平之間差異均無統計學意義(P>0.05)，結果見表2。

3 討論

RA是一種以關節滑膜慢性炎癥為主要特征的自身免疫性疾病，我國發病率約為0.24%～0.5%，女性多于男性，約為2～3∶1，主要表現為局部關節在早晨起床時不靈活、關節畸形、疼痛、腫脹、錯位等，并伴有不同程度的疲乏、低熱和體重減輕[7]，嚴重者病變還會累及全身各個器官，引起類風濕病，且RA為一種反復發作性疾病，致殘率較高，嚴重影響患者的生存質量和身體健康，且預后不良，目前還沒有很好的根治方法，早期診斷并積極誘導疾病緩解是防治并發癥的關鍵[8]。因此，加強RA發病機制的研究對RA的早期診斷、治療、預防及基因靶向治療藥物的研發具有重要的意義。

RA發病機制十分復雜，據有關文獻結論顯示，多種細胞因子、自身抗體及炎性物質通過相互調節、相互影響直接或者間接參與RA的發生和發展過程[9]。其中IL-17是一種由Th17細胞所分泌的促炎細胞因子，可誘導黏附分子、蛋白酶以及其他細胞因子的產生，在RA的發生和發展過程中發揮作用[10]。RF是一種抗人IgG分子Fc片段抗原決定簇的抗體，是以變性IgG為靶抗原的自身抗體，最初于1984年在RA患者血清中被發現。CRP是一種由肝細胞所合成，具有激活補體和促進粒細胞及巨噬細胞的吞噬作用的急性時相反應蛋白，在急性創傷和感染時其濃度急劇升高。有關研究表明，IL-17、RF及CRP濃度在RA患者血清中明顯升高。本研究結果顯示，RA組血清中IL-17，RF及CRP濃度明顯高于對照組健康人群，差異有統計學意義(P<0.05)，與國內外有關研究結論一致[5,6,8,11]，說明了IL-17，RF及CRP與RA疾病的發生和發展具有一定的相關性，對RA的診斷、療效判斷具有一定的參考價值。

目前為止，RA的病因仍不清楚，可能與環境、免疫及遺傳因素等有關，其中約50%的RA發病與遺傳基因易感性有關[12，13]。至今為止，已發現40多個與RA相關的SNP位點，IL-17F基因為其中之一[14]。IL-17F是由Th17細胞分泌的一種促炎因子，可誘導多種細胞因子和趨化因子的表達，從而加劇滑膜的炎癥反應及骨質的破壞[15]。近年來，有關研究發現IL-17F基因多個位點上存在基因突變，但不同地區和人群的遺傳背景、生活習慣及環境等因素的不同而導致SNP的基因多態性分布存在很大差異性，如有關文獻報道IL-17F基因某些突變與RA發病存在密切關系[7，9]，而另外有些研究卻未發現IL-17F基因多態性與RA易感性相關[10，16]。本研究結果顯示，深圳地區RA患者IL-17F基因位點rs763780 CC基因型及C等位基因檢出率明顯高于健康人群，差異有統計學意義(P<0.05)，與國內外部分文獻研究的結論相一致[7，9]，這可能與IL-17F基因位點rs763780 CC基因型及C等位基因是導致本地區RA發病的遺傳易感基因等有關，且CC基因型突變RA患者血清中IL-17濃度明顯高于其他基因突變類型的RA患者，差異有統計學意義(P<0.05)，而RF和CRP濃度改變與IL-17F基因位點rs763780基因型突變類型無關聯性，這可能與CC基因型突變僅影響到了IL-17的表達并改變細胞因子的結構等有關[14，17]，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，RA發病機制十分復雜，IL-17、RF及CRP在RA患者血清中明顯升高，同時IL-17F基因位點rs763780的SNP多態性分布與RA的發生和發展有密切相關性，且不同地區、不同人群因遺傳背景和生活環境因素的不同而存在很大差別。因此，加強不同地區、不同人群RA易感基因SNP多態性調查分析有助于RA的發病機制闡明，并為RA的診斷、治療和預后判斷提供有效的遺傳標志物。