四引物擴增受阻突變體系PCR 技術及其在動植物遺傳育種研究中的應用

余鈞劍 遲美麗 賈永義 劉士力 竺俊全 顧志敏

（1. 寧波大學海洋學院，寧波 315211；2. 浙江省淡水水產研究所，湖州 313001）

單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是指DNA 序列中單個堿基的變化，包括堿基的轉換、顛換、插入和缺失［1］，是繼限制性片段長度多態性（RFLP）和簡單重復序列（SSR）后的第3 代分子標記。SNP 標記具有突變位點數目多、遺傳穩定性高、有利于實現高通量檢測等優點［2］，因此被廣泛應用遺傳育種領域［1-3］。目前 SNP 的檢測方法大致可以分為兩大類：一大類是以單鏈構象多態性（SSCP）、變性梯度凝膠電泳（DDGE）、酶切擴增多態性序列（CAPS）、等位基因特異性 PCR（AS-PCR）等為代表的以凝膠電泳為基礎的傳統經典的檢測方法；另一大類是以直接測序、DNA 芯片、變性高效液相色譜（DHPLC）、質譜檢測技術、高分辨率熔解曲線（HRM）等為代表的高通量、自動化程度較高的檢測方法［4-5］。總體上，前者傳統的檢測方法對設備要求不高，投入成本低，但速度慢，很難實現高通量的 SNP 檢測；而后者的檢測方法能實現 SNP 高通量、自動化檢測，但對設備和技術要求高，成本很高。四引物擴增受阻突變體系PCR 技術是一種基于TaqDNA 聚合酶對位于引物3′末端堿基錯配無法修復，在普通PCR 基礎上，通過設計4個特異性的引物和優化擴增條件，實現對SNP 位點單管PCR 分型的檢測技術［6］，具有操作簡便、快速、能對SNP 進行分型、以及費用低等優點。本文詳細介紹了四引物擴增受阻突變體系PCR 的技術原理、優勢、結果檢測手段和反應體系改進方法，綜述了該技術在遺傳育種研究中的應用，為該技術在種質資源鑒定、分子標記輔助選擇以及分子設計育種等領域中的推廣應用提供理論基礎。

1 Tetra-primer ARMS PCR 技術原理

四引物擴增受阻突變體系PCR 簡稱四引物擴增法［7］，又被稱為兩對交叉引物PCR（PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP）［8］、 單 管雙向等位基因專一性擴增（Single-tube bi-directional allele specific amplification，SB-ASA）［9］和雙向PCR擴增特異等位基因（Bidirectional PCR amplification of specific alleles，Bi-PASA）［10］。該方法是Ye 等［7］在2001 年將Tetra-primer PCR 和ARMS 法結合，以單管PCR 反應為基礎，用以檢測DNA 中點突變的基因分型新方法。Tetra-primer ARMS PCR 是在等位基因特異性PCR（Allele specific PCR，AS-PCR）的基礎上發展起來的［11］，因此其基本原理相類似：在PCR 反應起始過程中，如果引物3′末端堿基與模板鏈上堿基按照堿基互補配對的原則反向互補，則延伸反應能正常進行，PCR 產物中有該引物相對應的特異性擴增產物。反之，如果引物3′末端堿基發生錯配，基于TaqDNA 聚合酶對位于引物3′末端堿基錯配無法修復，延伸反應不能正常進行，新鏈延伸速度低于上述引物3′末端堿基與模板鏈互補配對的延伸反應［12］。當錯配堿基數目達到一定程度，3′末端錯配的堿基與模板鏈間的磷酸二酯鍵形成受阻，擴增反應無法發生，PCR 產物中沒有該引物相對應的特異性擴增產物［13］。因此，可以根據PCR 結果能否得到特異長度的擴增條帶，確定模板DNA 上是否具有與引物3′末端相應的突變。

Tetra-primer ARMS PCR 技術需要根據其具體SNP 位點設計4 條不同的引物，分別在SNP 位點兩側設計2 條內引物（正向內引物N1 和反向內引物N2），在SNP 位點上下游不同距離（一般200-500 bp）分別設計2 條外引物（正向外引物W1 和反向外引物W2）。特異性內引物N1 和N2 延伸方向相反，分別與SNP 位點的兩個等位基因相對應，其中正向內引物N1 3′末端堿基與某一個的等位基因相同，反向內引物N2 3′末端堿基與另一個等位基因互補。在此PCR 反應體系中，正向外引物W1 和反向外引物W2 擴增包含突變位點的對照片段，正向外引物W1 和反向內引物N2 擴增一條代表野生型（或代表突變型）的特異性片段，正向內引物N1 和反向外引物W2 擴增另外一條代表突變型（或代表野生型）的特異性片段。特異性內引物用來檢測突變是否發生，外引物不但作為陽性參照而且和特異性內引物分別配對有選擇性地擴增突變型與野生型個體基因。通過特異性擴增產物片段的有無和長度大小，鑒定待測樣本是否為野生型、突變型或雜合型［11，14］。

2 Tetra-primer ARMS PCR 技術與常見SNP檢測方法的比較

Stephan 等［15］在類風濕性關節炎致病基因LTA多態性的研究中比較了限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（PCR-RELP）技術、高分辨率熔解曲線（HRM）分析、Sanger 測序法和Tetra-primer ARMS PCR 四種檢測SNP 的方法，發現它們檢測結果一致。但是與PCR-RELP 技術相比，Tetra-primer ARMS PCR 不需要用特異性內切酶消化切割PCR 產物，可以在PCR 完成后直接進行下一步的電泳，簡化了操作步驟，省去限制性內切酶所需的檢測成本和消化時間，同時又避免酶切不完全所造成的假陽性結果。而且PCR-RELP 僅僅只能夠檢測出位于酶切位點的SNP，Tetra-primer ARMS PCR 卻不受其限制。與HRM 相比，HRM 需通過飽和染料（如SYBRGreen、ResoLight、SYT09 等）對PCR 產物進行閉管檢測分析，但是要求檢測設備具有較高的升降溫速率及溫度均一性，若待檢測的DNA 片段GC 含量過高或SNP 位點過于集中，則無法進行HRM 檢測。Tetra-primer ARMS PCR 對設備硬件的要求低，只需常規PCR 儀和電泳設備就可以操作。Sanger 測序是檢測SNP 位點最直接可靠的方法，具有較高的靈敏度［16］，但是檢測費用較貴，操作繁瑣。關于Tetra-primer ARMS PCR 技術與其他常見SNP 檢測方法的比較，如ASPCR 對于某基因單個位點的檢測至少需要雙管反應才能進行SNP 分型，Tetra-primer ARMS PCR 將反應集中到一個體系內進行，由于利用了引物間對 DNA 模板的競爭性結合，所以提高了檢測系統的靈敏度和特異性，同時簡化實驗操作步驟，進而節省一定時間和成本［7］。而Taqman 熒光探針法可以特異、快速、高效、自動化地實現SNP 分型，但是由于探針的高費用，導致檢測成本較高。目前大量研究證明通過設計4 條特異性引物進行Tetra-primer ARMS PCR、電泳，在2-3 h 可以實現單管基因分型，檢測結果也與直接測序一致［17-18］。

因此與常見SNP 檢測技術相比，Tetra-primer ARMS PCR 操作簡單快速、價格低廉，在具備常規PCR 條件的實驗室都可以開展，易于推廣。但是該技術也有其局限性，如引物設計要求高、對于擴增條件要求嚴格。因此如何設計SNP 位點特異性內引物和如何改進反應條件獲得清晰條帶，對該技術的應用非常重要。

3 Tetra-primer ARMS PCR 反應體系的改進方法

Tetra-primer ARMS PCR 引物設計是決定該技術檢測靈敏度和準確性的關鍵，其次反應體系的優化也能提高PCR 反應的特異性，從而防止引物與靶DNA 配對時可能發生的錯配延伸，出現假陽性條帶。反應體系通常從內外引物濃度和比例、反應溫度、靶DNA 濃度、TaqDNA 聚合酶的用量和種類以及Mg2+濃度等在幾個方面進行改進。

3.1 引入錯配堿基

除了內引物3′末端堿基必須落在突變的位置上，為提高擴增的特異性和靈敏度，還可以在靠近內引物3′端的位置人為地引入錯配堿基，這樣對于匹配者有一個錯配，而對于非匹配者則存在兩個錯配，大大地減少了非特異擴增。一般來說，人為錯配堿基多位于引物 3′端倒數第二或三位。特異性高低還取決于堿基的錯配類型，如果 3′端是高度不穩定的錯配（A/G、T/T 或C/T），則需要引入較弱的錯配（C/A 或G/T）或不引入錯配，反之亦然［19］。

3.2 內外引物濃度和比例

內外引物濃度和比例是優化Tetra-primer ARMS PCR 反應體系的重要方面。若引物濃度過高，會導致引物與模板的非特異性結合機率增大而出現假陽性；若濃度過低則擴增產物少條帶不清晰。Tetraprimer ARMS PCR 反應4 個引物集中于一個體系內進行，引物間存在與DNA 模板的競爭性結合，需要調節內外引物比例提高檢測的特異性擴增。Ye 等［7］認為內外引物濃度之比為10∶1 并結合Touchdown PCR 時的檢測靈敏性最高。鄭煒佳等［20］把內外引物控制在4∶1 時得到較滿意的特異性條帶。姜樹朋等［17］發現在內外引物之比為 1∶2 時特異性最好。所以不同的反應體系內外引物濃度和比例不同，一般來說，適當增加內引物濃度比例，可以增加特異性擴增片段的擴增量，提高檢測的靈敏度。另外，擴增片段較長的引物由于擴增效率較低，需要適當提高引物濃度。

3.3 退火溫度

Tetra-primer ARMS PCR 反應中退火溫度越高，引物與模板的堿基互補結合越嚴格，擴增特異性越好，但特異性產物的量將減少；反之退火溫度越低對特異性引物與模板的結合就越有利，但過低的退火溫度會使非特異性擴增增多，出現假陽性結果。實驗中一般在一定溫度范圍內對反應體系進行優化，以確定最佳的退火溫度［21-23］。

3.4 其他方法

熱啟動TaqDNA 聚合酶可以提高PCR 的分型效果。Alyethodi 等［24］發現使用熱啟動TaqDNA 聚合酶代替TaqDNA 聚合酶就能顯著提高特異性擴增效率，反應更靈敏。王瑞恒等［25］比較了TaqDNA聚合酶、ExTaqDNA 聚合酶以及熱啟動ExTaqDNA聚合酶，發現熱啟動ExTaqDNA 聚合酶的擴增效果最好。TaqDNA 聚合酶的用量、靶DNA 濃度、Mg2+濃度以及dNTP 的濃度也會對擴增的靈敏度和特異性產生影響，可以設定若干不同濃度進行驗證優化［26-28］。此外，采用Touchdown PCR 可以顯著增加反應的特異性［29-30］。

4 Tetra-primer ARMS PCR 技術檢測手段

最初，由于Tetra-primer ARMS PCR 擴增的兩條特異性產物長度不同，實驗者使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測。近年來通過結合其他檢測設備、對引物進行熒光標記等方法，Tetra-primer ARMS PCR 的檢測手段也不斷改進，操作步驟得以簡化，靈敏度也越來越高。

4.1 Tetra-primer ARMS PCR結合瓊脂糖凝膠電泳

在傳統的 Tetra-primer ARMS PCR 中，擴增產物一般直接應用電泳來檢測。Tetra-primer ARMS PCR反應中上游和下游引物到突變點距離不同，因此在電泳圖譜中得到大小不同的特異性譜帶。根據 3′末端特異性引物阻斷類型和電泳圖譜中譜帶大小以及有無，可以直接判斷個體的基因型。該方法具有簡便快速、設備要求低及價格低廉等特點［26］，是該技術相對其他技術的優點所在。

4.2 Tetra-primer ARMS PCR結合毛細管電泳

Vannucchi 等［31］在2006 年首次將Tetra-primer ARMS PCR 與毛細管電泳結合，并且成功檢測到酪氨酸激酶2（JAK2）基因的點突變。丁子軒等［32］在2018 年通過Tetra-primer ARMS PCR 結合毛細管電泳法對淋巴瘤患者 MYD88 基因 L265P 突變進行分型，在PCR 反應中，上游內引物和下游內引物的 5′端均用熒光基團修飾，將 PCR 產物經過處理后進行毛細管電泳，MYD88 基因野生型和突變型分別在不同堿基序列長度處出現特異性單峰峰圖。該方法將突變位點檢測靈敏度提高到約1%的突變比例，顯著高于傳統的直接測序法［31-34］。而且該方法通過設計長度和熒光波長不同的內引物，對多個基因突變位點進行擴增后混合上樣進行毛細管電泳，能同時檢測多個位點［35］，進一步減少檢測時間和試劑成本，如段素霞等［36］建立改進的四引物擴增受阻突變體系PCR 檢測方法，結合QIAxcel 毛細管電泳分析擴增產物長度，實現單管一次性檢測葉酸代謝過程相關基因的4 個SNP 位點。

4.3 Tetra-primer ARMS PCR結合熔解曲線

除了以上電泳檢測手段，熔解曲線法也被應用到Tetra-primer ARMS PCR 檢測過程中來。Liu 等［37］將四引物擴增受阻突變體系PCR 和熔解曲線技術相結合，在臨床實驗室檢測骨髓增生性腫瘤（MPNs）的分子標志基因JAK2 的V617F 突變，準確性為100%，分析靈敏度為1.25%。該方法要求將四引物擴增受阻突變體系PCR 擴增的產物按一定速率升溫變性，同時監測熒光信號的變化，繪制熔解曲線。當存在突變時，就能得到不同的 PCR 產物，而不同片段長度的 PCR 產物，就會形成不同 Tm 值的熔解曲線。根據熔解曲線波峰的多少和擴增的特異性條帶所代表的堿基種類，就可以準確區分野生型純合子、雜合子和突變性純合子。Baris 等［38］應用此方法成功檢測出FV、PII、MTHFR 和FGFR3 基因中的常見突變，該方法不僅可以減少電泳檢測方法繁瑣的操作步驟，避免可能引起的污染，還具有低成本、高通量的優點。

關于SNP 的研究越來越受到人們關注，與之相對應的檢測技術也得到了快速發展。傳統的瓊脂糖凝膠電泳檢測手段設備要求低，一般分子生物學實驗室的條件均可滿足該實驗要求，價格也較低廉，容易推廣。而毛細管電泳和熔解曲線檢測手段對設備和技術要求高，成本也較昂貴。與傳統檢測手段相比，Tetra-primer ARMS PCR 結合毛細管電泳大大提高檢測突變位點的靈敏度，還可定量檢測基因突變，準確性接近實時定量PCR，通過一次電泳可同時檢測多個位點。Tetra-primer ARMS PCR 結合熔解曲線技術則進一步簡化操作步驟，將Tetra-primer ARMS PCR 反應過程和結果檢測集中同一PCR 管。因此，小規模、靈敏度要求低的SNP 測序，可采用傳統的瓊脂糖凝膠電泳檢測手段，而毛細管電泳和熔解曲線檢測手段更適合準確性高的高通量檢測。

5 Tetra-primer ARMS PCR 技術在動植物遺傳育種研究中的應用

5.1 構建遺傳連鎖圖譜

遺傳連鎖圖譜的構建是對基因組進行系統研究的基礎，也是動植物遺傳育種的依據。利用DNA 分子標記技術構建的遺傳連鎖圖譜，標記控制重要經濟性狀的基因，再利用定位克隆技術克隆這些基因，通過分子標記輔助育種，結合常規育種方法對經濟物種進行遺傳改良，最終生產出優質高產抗逆的優良品種［39］。SNP 分子標記在基因組中非常豐富且突變率低，可用于構建高精度的遺傳圖譜［40］。張建勇［41］以中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）F1 家系為作圖群體，利用Tetra-primer ARMS PCR 技術對轉錄組高通量測序預測的單核苷酸突變進行分型，構建了具有200 個SNP 位點標記的中國對蝦父母本的遺傳連鎖圖譜。張紫晉［42］設計38 對Tetra-primer ARMS PCR 引物對攜帶抗條銹病基因Yr41 的小麥抗病品種川農19（CN19）進行SNP 檢測，繪制出Yr41 基因的精細連鎖遺傳圖。因此，通過Tetra-primer ARMS PCR 技術檢測和開發的SNP 分子標記具有較高的準確性，可滿足遺傳連鎖圖譜的構建要求。

5.2 輔助選育和分子標記開發

Tetra-primer ARMS PCR 技術已經在多個物種中進行過與生長性狀相關研究。彭娜等［43］對中華鱉（Trionyx Sinensis）IGF2 基因中2 個SNP 位點進行分型，分型結果與生長性狀的關聯系分析結果表明2 個SNP 位點具有用作中華鱉生長性狀分子標記輔助育種的潛力。Zhang 等［44］開發2 個與秦川肉牛（Bovine）ACADVL 基因相關的SNP 位點，該基因對秦川肉牛的胸寬、胸深和髖寬有顯著影響，可以作為選擇秦川肉牛中具有優良生長性狀個體的DNA 標記。在水稻中，研究者結合四引物擴增受阻突變體PCR 的技術原理開發基因功能標記，可準確區分水稻高氮利用率NRT1.1B 基因的純合顯性、純合隱性和雜合基因型，可廣泛應用于水稻NRT1.1B 基因的資源鑒定和分子標記輔助選擇育種［45］。在與繁殖性狀相關SNP 研究中，管峰等［46］建立一種BMPR-IB基因的Tetre-primer ARMS PCR 檢測方法，準確判斷綿羊個體中這一控制多胎性狀的主效基因的基因型。Ahlawat 等［47］通 過Tetre-primer ARMS PCR 成 功 對黑孟加拉山羊（Capra aegagrus hircus）Fec 基因中鑒定的3 個新SNP 進行了基因分型，確定該基因與黑孟加拉山羊生殖力相關。在與抗病性狀相關SNP 研究中，研究員分別建立了苦瓜［48］、辣椒［49］、牛［50］等抗病基因的Tetra-primer ARMS PCR 檢測方法。綜上所述，Tetra-primer ARMS PCR 技術可以作為一種非常有力的工具應用于輔助選育，將極大推動動植物遺傳育種進程。

5.3 品種鑒定

品種鑒定技術現已由傳統表型鑒定發展到分子標記技術鑒定，SNP 分子標記的應用能夠為品種鑒定提供準確、快速的檢測渠道。田孟祥等［45］針對水稻S5 基因設計Tetra-primer ARMS PCR 引物，能很好地對水稻秈粳屬性進行區分，為利用秈粳雜種優勢的親本有效選擇和秈粳分化研究提供重要參考。朱二勇［51］利用Tetra-primer ARMS PCR 對BMPR-IB基因分型研究中，開發用于策勒黑羊、多浪羊、湖羊以及中國美利奴羊（新疆型）品種特異性鑒定的SNP 分子標記。姚姝等［52］通過開發水稻Pi-ta、Pi-b和Wx-mq 基因SNP 分子標記對水稻品種南粳46、南粳5055 和南粳9108 進行品種鑒定，并且成功進行多基因聚合育種，選育出水稻新品系南粳0051。

6 小結

作為第三代分子標記技術，SNP 以其多態性豐富、在基因組中分布密度大等優勢，在遺傳育種、物種親緣關系鑒定、種質鑒定、種質資源保存與管理、基因庫構建等研究領域具有廣闊的應用前景和發展潛力。Tetra-primer ARMS PCR 技術作為一種操作簡單快捷、準確性高、低成本的SNP 分型技術，應用前景廣闊。目前，Tetra-primer ARMS PCR 技術的發展方向主要在于通過與其他檢測技術結合，使得其可滿足大規模樣本檢測的要求、具有更高的檢測靈敏度和準確性等優勢，同時進一步簡化實驗操作步驟，降低成本。隨著SNP 分子標記技術的飛速發展和Tetra-primer ARMS PCR 技術的不斷完善，該技術必將廣泛應用于動植物遺傳育種研究，為實驗者提供一種簡便且成本低廉的SNP 分型手段。