黑棗果酒發酵過程主要成分變化規律及香氣成分分析

昝立峰，楊香瑜，陳江魁，殷春燕

（邯鄲學院生命科學與工程學院，河北省高校冀南太行山區野生資源植物應用研發中心，河北邯鄲056005）

黑棗，學名君遷子（Diospyros lotus L.），屬于柿樹科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros），落葉喬木[1-2]。主要分布于中國北方地區，河北的涉縣、贊皇，山西的平順、左權，山東的鄒平、淄博，湖南的洞口等地均有成片的栽培，其中河北涉縣無核黑棗種植面積達2.5 萬余畝，每年可產黑棗7 000 多噸，但因缺乏相應的深加工技術，大量果實無人采摘，造成了資源浪費。無核黑棗果酒的研制為黑棗資源的開發利用提供了有效的途徑[3-4]。黑棗入脾胃經，能補中養氣、養血、安神及明目，多用于補血和作為調理藥物，對貧血、血小板減少、肝炎、乏力、失眠有一定的療效[5-7]。

無核黑棗含有豐富的營養成分，尤其是還原糖、果膠、維生素、氨基酸的含量極為豐富，是研制多種食品、飲料、果酒、保健品的理想原料[8-9]。同時黑棗中含有大量的多酚類化合物，包括沒食子酸、沒食子酸甲酯、倍酸甲酯、鞣花酸、單寧酸、山萘酚、槲皮素、楊梅素及其衍生物等，這些多酚化合物具有良好的抗氧化、抗腫瘤、鎮靜和抑制HIV-1 病毒作用[10-13]。本試驗分析河北涉縣產無核黑棗果酒發酵過程中主要營養成分的變化規律，同時對該工藝條件下黑棗果酒香氣成分進行分析，以期為發酵型黑棗果酒的進一步開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無核黑棗于2018 年11 月采自河北省涉縣井店鎮；安琪果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（酶活力10×104U/g）：河南臻玉實業有限公司；檸檬酸（食品級）：濰坊英軒實業有限責任公司；白砂糖：北京康普匯維科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BioFlo/CelliGen115 發酵罐：New Brunswick Scientific 公司；PHS-3E pH 酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；PAL-1 數顯折射儀、PAL-33S 酒精濃度計：廈門森態儀器儀表有限公司；MKJ-J1-4 型實驗室微波爐：青島邁威微波技術應用有限公司；CLARUS 680氣相色譜-質譜聯用儀：Perkin Elmer 公司。

1.3 方法

1.3.1 黑棗果酒發酵工藝流程

果實精選→清洗→切片→熱水浸提→果膠酶處理→調糖→調酸→高溫滅菌→接種發酵→后發酵→澄清過濾→灌裝→檢驗→成品

1.3.2 操作要點

1）黑棗汁制備：將無核黑棗切成1 mm～2 mm 的薄片，稱取100 g 于燒杯中加入純水500 mL，置于微波爐中在功率為400 W 條件下微波處理5 min，然后于85 ℃下浸提得到黑棗汁，降溫至50 ℃～55 ℃，添加0.2%果膠酶保溫2 h。

2）調糖、調酸：過濾后的黑棗汁用白砂糖將可溶性固形物含量調到20%，檸檬酸調節pH 3.5。

3）主發酵：向250 mL 錐形瓶中加入100 mL 黑棗汁，在黑棗汁中加入0.2 %安琪黃酒高活性酵母，在27 ℃條件下恒溫發酵9 d。

4）后發酵：主發酵結束后，將酒腳分離，置于10 ℃后發酵30 d。

5）澄清：用0.2%的硅藻土澄清，過濾。

1.3.3 測定方法

糖度測定：數顯折射儀進行測定；酒精度測定：酒精濃度計測定發酵液的蒸餾液中的酒精度；還原糖含量按照NY/T 1508-2017《綠色食品果酒》中的方法測定[14]。

參考GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[15]，可溶性固形物的測定采用折光儀法；總酸的測定采用酸堿滴定法；脂肪的測定采用酸水解法；蛋白質含量的測定采用凱氏定氮法；還原糖的測定采用斐林試劑法；VC的測定采用2，6-二氯靛酚滴定法；多酚的測定采用福林酚法。

1.3.4 氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）分析

將黑棗果酒用GC-MS 進行成分分析。參考文獻[16]，色譜條件：色譜柱為HP-1（30 m× 0.25 mm ×0.25 μm），載氣為氦氣，流速 1.2 mL/min；初始柱溫為40 ℃，保持 3 min；以 20 ℃/min 的速率升溫到 240 ℃，保持 10 min；進樣量 1 μL，分流比為 20 ∶1。質譜條件為EI 離子源，源溫度為50 ℃，接口溫度為50 ℃，電子能量為70 eV；質量掃描范圍為15 Da～500 Da。

1.3.5 成品質量

在1.3.2 工藝流程下發酵無核黑棗果酒，黑棗果酒成品的質量指標如下：

感官指標：顏色呈深紅色，澄清透明，無懸浮物及沉淀物；有淡淡的黑棗香氣，與酒香協調，無異味；酒體醇厚豐滿，酸甜適口。

理化指標：酒精度：11.8%vol；可溶性固形物含量8.55%；還原糖含量1.32g/L；總酸含量3.25%。

微生物指標：細菌總數≤50 cfu/mL；大腸菌群≤3 MPN/100 mL；致病菌未檢出。

產品質量符合國家標準。

2 結果與分析

黑棗果實中營養成分的含量如表1 所示。

2.1 發酵過程中可溶性固形物含量的變化

黑棗果酒在發酵過程中可溶性固形物含量的變化如圖1 所示。

表1 黑棗果實的營養成分含量[8]Table 1 The contents of nutuitional composition from date plum fruit

圖1 黑棗果酒發酵過程中可溶性固形物含量變化Fig.1 The change of soluble solids in fermentation process of date plum fruit wine

從圖1 可以看出，在發酵過程中，可溶性固形物含量逐漸下降。在黑棗果酒發酵最初階段，酵母菌活性較好，大量消耗了試驗中加入的蔗糖和黑棗本身所含的糖分。隨著時間的推移，酵母菌活性不斷下降，可溶性固形物含量緩慢下降，直至發酵結束。

2.2 發酵過程中還原糖含量的變化

發酵過程中還原糖含量的變化如圖2 所示。

圖2 黑棗果酒發酵過程中還原糖含量變化Fig.2 The change of reducing sugar in fermentation process of date plum fruit wine

從圖2 可以看出還原糖含量的變化整體呈下降趨勢，發酵1 d～3 d 下降速度較快，被消耗的還原糖主要用于酵母菌的生長繁殖，而生成的酒精相對較少。但是在接下來的第3 天到第5 天，還原糖含量反而略有增加，可能因為發酵液中的一些蔗糖和多糖被水解成還原糖而使其含量升高。之后隨著酵母菌的利用，還原糖含量又呈急劇下降趨勢，此時還原糖被酵母轉化形成酒精，直至發酵結束，黑棗果酒中的還原糖含量降至發酵最低水平。

2.3 發酵過程中酒精度的變化

黑棗果酒在發酵過程中酒精度與發酵時間的關系如圖3 所示。

圖3 黑棗果酒發酵過程中酒精度變化Fig.3 The change of alcoholicity in fermentation process of date plum fruit wine

在發酵過程中，果汁中的還原糖在酵母菌的作用下轉化為酒精。由圖3 可知，在發酵的前3 天，由于酵母菌的大量繁殖，糖分主要用于菌種的生長，酒精度增加相對緩慢。在發酵的第4 天到第7 天，發酵液中形成大量的乙醇，酒精度快速上升，發酵過程中表面有大量的氣泡產生。而第8 天以后，發酵趨于平緩，酒度緩慢上升，酒精發酵基本結束。

2.4 發酵過程中總酸含量的變化

發酵過程中總酸含量與發酵時間的關系如圖4所示。

圖4 黑棗果酒發酵過程中總酸含量變化Fig.4 The change of total acid in fermentation process of date plum fruit wine

從圖4 中可以看出，總酸含量在發酵的前5 天呈現一個上升趨勢，酵母菌利用黑棗中還原糖以及加入的蔗糖進行發酵，糖的降解會通過戊糖磷酸途徑（hexose monophophate pathway，HMP） 等其他方式進行，在這些途徑中會產生乳酸、檸檬酸等一些有機酸[17]，因此，在發酵過程中總酸含量逐漸上升，這樣有利于抑制其它雜菌的生長。隨著發酵的進行，酵母菌活性逐漸下降以及糖含量逐漸下降致使有機酸的合成減少，有機酸和酒槽、單寧、色素等其它物質的結合，維持在一個比較穩定的水平，并略有下降，這些與其他果酒發酵過程中的規律是一致的。

2.5 發酵過程中蛋白質含量的變化

發酵過程中蛋白質含量的變化如圖5 所示。

圖5 黑棗果酒發酵過程中蛋白質含量變化Fig.5 The change of protein in fermentation process of date plum fruit wine

由圖5 可知，在發酵1 d～3 d 內，蛋白質含量沒有下降，3 d 后蛋白質含量呈現明顯下降趨勢，7 d 后發酵趨于穩定。蛋白質含量的下降，一是由于發酵過程中酵母菌消耗蛋白質作為氮源，二是由于發酵過程中大分子的蛋白與其他物質，如單寧等結合生成沉淀。

2.6 發酵過程中脂肪含量的變化

發酵過程中脂肪含量的變化如圖6 所示。

圖6 黑棗果酒發酵過程中脂肪含量變化Fig.6 The change of fat in fermentation process of date plum fruit wine

由圖6 中可以看出，在發酵過程中脂肪含量逐漸下降。黑棗汁中的脂肪在發酵過程中，首先被酵母菌中的脂肪酶作用，分解成甘油和脂肪酸。甘油分解果酒中的單寧，提升果酒的品質和口感，去除苦澀味。脂肪酸受到酵母菌的氧化作用而生成低級脂肪酸。脂肪酸是形成酯的前體物質，酯與高級醇一起形成黑棗酒特有的芳香味，因此脂肪含量隨發酵時間的延長而降低。

2.7 發酵過程中VC含量的變化

黑棗果酒發酵過程中VC含量與發酵時間的關系如圖7 所示。

圖7 黑棗果酒發酵過程中VC 含量變化Fig.7 The change of vitamin C in brewing process of date plum fruit wine

無核黑棗中VC含量較高，VC屬己糖衍生物，存在還原型（抗壞血酸）與氧化型（脫氫抗壞血酸）兩種結構形態，還原型VC（抗壞血酸）在有氧和無氧條件下均可分解[18]。本文采用2，6-二氯靛酚法測定還原型VC，VC含量的多少是衡量果酒營養價值的重要指標。從圖7 可以看出，黑棗酒發酵過程中VC含量逐漸下降，最后趨于穩定。這是因為隨著發酵時間的延長，發酵液中的VC被有氧或無氧分解。

2.8 發酵過程中多酚含量的變化

發酵過程中多酚含量與發酵時間的關系如圖8所示。

圖8 黑棗果酒發酵過程中多酚含量變化Fig.8 The change of polyphenol in brewing process of date plum fruit wine

從圖8 可以看出，在黑棗酒發酵初期多酚的含量略有增加后有所下降，7 d 后趨于平穩。可能是在發酵初期，由于檸檬酸的加入，使溶液中的酸度增大，在酸性溶液中更有利于多酚從細胞中溶出。但是隨著發酵的進行，多酚發生氧化或者與蛋白質結合，從而使多酚的含量又逐漸降低后趨于穩定。黑棗果酒的澀味就是由多酚引起的。多酚類物質具有抗氧化、增強免疫功能、抗癌、抗衰老、調節毛細血管、抗菌、消炎、抗病毒、降血壓、降血脂、抗血栓等生物學作用[19]。果酒中的多酚類物質賦予果酒一定的顏色，同時賦予果酒醇厚豐滿、結構穩定、后味悠長的特點，還可以提高酒的耐貯存和抗氧化能力，因此它是構成果酒感官品質的重要因素之一[20]。

2.9 黑棗果酒的香氣成分分析

黑棗果酒GC-MS 所得到的總離子流圖見圖9。

圖9 黑棗果酒香氣成分GC-MS 總離子流色譜圖Fig.9 GC-MS total ion chromatogram of aroma components from date plum fruit wine

圖9 中峰形、離子豐度和分離度均較好，滿足分析的要求。將分離得到的單組份色譜峰對應的質譜圖與NIST11 譜庫中質譜圖進行檢索匹配，分離得到的所有組分對應質譜檢索正負匹配較高的化合物鑒定結果列于表2 中。

從無核黑棗果酒香氣成分中共鑒定出匹配度較高的18 種成分，包括烷烴類物質9 種、酯類物質8 種和1 種羥胺物質，結果發現該工藝條件下果酒的主要香氣成分為烷烴類和酯類物質，其它類物質相對較少。酯類物質也是酵母在發酵過程中的代謝產物，在無核黑棗果酒的香味方面發揮著重要的作用，如黑棗果酒中的己酸乙酯是濃香型果酒的主體香氣，乙酸乙酯是果酒的基礎芳香物質，是最重要的主體酯類，其它酯類物質也在不同程度上影響著果酒的香味。

表2 無核黑棗果酒香氣成分分析Table 2 Analysis of aroma components from date plum fruit wine

3 結論

在以河北涉縣產無核黑棗為原料，發酵果酒過程中可溶性固形物、還原糖、蛋白質、脂肪、VC的含量隨著發酵時間的變化而降低，而酒精度、總酸的含量卻隨著發酵時間的延長而上升，在發酵初期多酚含量略有增加，隨后緩慢下降并保持穩定的水平。該工藝條件下，涉縣無核黑棗果酒中酯類和烷烴類物質構成香氣成分的主體，其它成分含量相對較少，賦予了黑棗果酒主要香氣特征。