柴油尾氣顆粒對秀麗隱桿線蟲慢性毒性效應的初步研究

吳軒 ，曾葭儀，修光利 ,

1. 上海市環境保護化學污染物環境標準與風險管理重點實驗室/華東理工大學資源與環境工程學院，上海 200237；2. 國家環境保護化工過程環境風險評價與控制重點實驗室/華東理工大學資源與環境工程學院，上海 200237；3. 上海污染控制與生態安全研究院，上海 200092；4. 華東師范大學第二附屬中學，上海 200241

柴油機具有高能效、高熱效率、低成本等優點，在重型卡車、工程機械、船舶等領域得到了廣泛的應用。根據生態環境部發布的《2018年中國機動車環境管理年報》，2017年全國柴油車保有量1956.7萬輛，占汽車保有量的9.4%，雖然保有量低于汽油車，但其氮氧化物和顆粒物排放量分別占機動車總排放量的70%和90%以上。2012年國際癌癥研究機構（IARC）將柴油機尾氣確定為人類致癌物（Kurt，2012）。柴油機尾氣顆粒（diesel exhaust particles，DEP）是由柴油不完全燃燒產生的，70%的粒徑小于0.3 μm，屬于典型的細顆粒物，對室外空氣PM2.5有重要貢獻。柴油機尾氣顆粒（DEP）由碳核和被其表面吸附的各種物質如可溶性有機物（Soluble Organic Fraction，SOF）、重金屬、硫酸鹽等組成，其中90%的可溶性有機物都具有致癌、致畸、致突變性（劉樹模等，2007），對人類身體健康危害極大。DEP能長時間在大氣環境中懸浮，且排放源距人類較近，可通過呼吸作用進入人類呼吸道及肺部并沉積，造成肺部炎癥反應（Sundeep et al.，1999）。除了肺部急性炎癥外，也有研究表明柴油機尾氣顆粒（DEP）與很多疾病密切相關，如神經學效應（Shannon，2011）、呼吸系統疾病（Ristovski et al.，2012；Inoue et al.，2007）、心血管系統疾病（Suleimani et al.，2017）及生殖健康及子代發育的影響等（Chunmei et al.，2009；方芳等，2008）。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）作為模式生物已被廣泛應用于水體（王曉祎等，2009），土壤（Hoss et al.，2009）和大氣（王云彪等，2012）等環境介質毒理安全性評價。秀麗隱桿線蟲體長約1 mm，呈透明狀，其繁殖率高，壽命相對較短，僅3周左右，實驗周期短，實驗成本低，并且線蟲的基因組已被完全測序，就人類基因組而言同源性可高達 60%—80%（Mano et al.，2007；Corsi，2006），是分子生物學中非常重要的工具（Brenner，1974；Chen et al.，2013），為化學品毒性效應研究提供了一個有效的評價載體。如今秀麗隱桿線蟲的運動行為、生長發育、生殖水平、壽命子代數目、基因表達、ROS水平等指標已被廣泛運用于如殺蟲劑等內分泌干擾物（Zhou et al.，2016；何雪珠等，2018；金司儀等，2018）、重金屬、納米材料（Hongbo et al.，2009；Meyer et al.，2010；Khare et al.，2011）和有機農藥（Dengg et al.，2004）的生態毒理學評估。

近年來已有研究（張文靜等，2019）基于秀麗隱桿線蟲對 PM2.5進行有效的快速風險評價，通過模式生物秀麗隱桿線蟲的應激響應，發現 PM2.5可能對人體行為、免疫及生殖等方面都有不同程度的影響。而作為 PM2.5的重要組分，柴油機尾氣顆粒能否影響機體運動能力及生長發育尚不明確，且缺乏其對機體生化指標影響的報道。研究報道環境空氣中 DEP 的濃度范圍為 10—5570 μg·m-3（Ghio et al.，2012），人群接觸DEP往往是長期且微量的，現有研究僅局限于高濃度短期急性暴露下 DEP的毒性，仍缺乏對其環境濃度下慢性毒性效應的探究。本文通過監測低濃度柴油機尾氣顆粒（DEP）慢性（10 d）暴露下線蟲的生理指標和生化指標，如頭部擺動頻率、體長、體寬、氧化應激、細胞凋亡水平和脂褐素水平來探討柴油尾氣顆粒影響下線蟲的生理行為響應，從而進行柴油尾氣顆粒的毒性效應評價。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑及儀器

試劑藥品：SRM2975標準品（美國國家標準與技術研究院），N2秀麗隱桿線蟲（野生型），2, 7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCF-DA，純度≥97%，阿拉丁試劑上海有限公司），吖啶橙（C17H19N3，純度≥99%，阿拉丁試劑上海有限公司），大腸桿菌菌株（E.coli OP50），瓊脂（西班牙 BIOWEST 公司），酵母蛋白胨（英國OXOID公司），膽固醇、二甲基亞砜、無水乙醇、氯化鈉、氯化鉀、次氯酸鈉、無水氯化鈣、無水硫酸鎂等化學藥品均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

儀器設備：SZM45B1型體視顯微鏡（舜宇光學科技（集團）有限公司），Nikon Eclipse 80i熒光顯微鏡（尼康儀器（上海）有限公司），生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司），VD-650型桌上式潔凈工作臺（浙江蘇凈凈化設備有限公司），LDZM立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）。

1.2 線蟲培養與同步化

用移液槍吸取2 mL無菌K-medium從NGM培養基表面沖洗大量處于產卵期的秀麗隱桿線蟲[雌雄同體株，美國線蟲遺傳中心(CGC)]，轉移至離心管于3000 r·min-1下離心2 min，棄去上清液后加入1 mL新鮮配制的裂解液（NaOH 1 g，NaClO 1 mL，K-medium 14 mL），上下振蕩搖勻，裂解3 min后于3000 r·min-1下離心2 min，棄去上清液，用無菌的K-medium反復清洗底部沉淀3次，充分洗去裂解液成分。將裂解得到的蟲卵轉移到涂有 E. coli OP50的NGM培養基上，放置于20 ℃恒溫培養箱下孵化并培養48 h，得到同步化的L4期幼蟲。

1.3 DEP的表征方法

利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察柴油機尾氣顆粒物（DEP）粉末狀態時的表面形態。用非常窄的電子束來回掃描樣品，并且通過樣品和電子束的互相作用，從而形成各種效應，主要為樣品的二次電子發射效應。

1.4 染毒液配制及染毒方法

由于柴油尾氣顆粒SRM2975顆粒難溶于水，故選用二甲基亞砜（DMSO）作為SRM2975顆粒的助溶劑，稱取0.01 g SRM2975顆粒于100 mL容量瓶，以DMSO定容，配制成濃度為100 mg·L-1的染毒母液。為保證空白對照組和暴毒組的DMSO濃度保持一致，接下來的實驗濃度采用等梯度稀釋法實現，最終的DMSO質量分數為0.1%。根據環境中DEP的質量濃度范圍，以0.1 mg·L-1為染毒濃度范圍的中值，向低劑量組和高劑量組延伸，設置染毒液質量濃度分別為 0（對照）、0.001、0.01、0.1、1 mg·L-1。

暴毒實驗使用6孔培養板，每孔加入上述同步化培養到L4期的秀麗隱桿線幼蟲及10 mL不同濃度的染毒液，放置于20 ℃恒溫培養箱染毒10 d，每隔24 h更換染毒液并加入100 μL E. coli OP50。暴毒結束后收集 6孔培養板內的線蟲，用無菌K-medium清洗3次用于后續指標測定。

1.5 DEP在秀麗隱桿線蟲體內的分布情況

暴毒結束后，向經不同濃度組暴毒后并清洗完畢的線蟲中加入 100 μL 60 μmol·L-1的左旋咪唑溶液，待麻醉1 min后用移液槍吸取適量線蟲至NGM固體培養基上，在體視顯微鏡下觀察并拍攝線蟲的身體形態。

1.6 秀麗隱桿線蟲生理指標的測定

1.6.1 頭部擺動頻率測定

根據文獻報道的測定方法（Tsalik et al.，2003），將經不同濃度組暴毒后并清洗完畢的線蟲轉移至NGM固體培養基上，待其恢復1 min后，于體視顯微鏡下觀察并記錄其20 s內頭部擺動的次數（線蟲頭部從一側擺到另一側再擺回此側），各濃度組至少記錄30條秀麗隱桿線蟲。

1.6.2 體長體寬測定

根據文獻報道的測定方法（周棟，2016），將經不同濃度組暴毒后并清洗完畢的線蟲置于 70 ℃水浴中45 min，燙死的線蟲呈直線狀態，在體視顯微鏡下觀察拍照，結合顯微鏡微尺和圖像分析系統（ipwim 32軟件）處理記錄線蟲身體的長度和寬度，各濃度組至少記錄30條秀麗隱桿線蟲。

1.7 秀麗隱桿線蟲的生化指標的測定

1.7.1 活性氧自由基測定

根據文獻報道的測定方法（周棟，2016），向經不同濃度組暴毒后并清洗完畢的線蟲中加入1 mL 2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCFDA），放置于20 ℃恒溫培養箱培養染色2 h，然后反復清洗3次去除熒光染劑成分。再加入 100 μL 60 μmol·L-1的左旋咪唑溶液，待麻醉1 min后用移液槍吸取適量線蟲于瓊脂糖墊上，于Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡下觀察每組線蟲熒光并捕捉圖像，濾鏡選擇FITC。運用 ImageJ軟件處理計算線蟲的平均熒光強度值，反映線蟲的 ROS水平，每個濃度組處理15條線蟲。

1.7.2 脂褐素測定

根據文獻報道的測定方法（周棟，2016），向經不同濃度組暴毒后并清洗完畢的線蟲中加入100 μL 60 μmol·L-1的左旋咪唑溶液，待麻醉 1 min后用移液槍吸取適量線蟲于瓊脂糖墊上，于Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡下觀察每組線蟲腸道的自發熒光并捕捉圖像，濾鏡選擇 UV-2A。運用ImageJ軟件處理計算線蟲腸道的平均熒光強度值，反映線蟲體內脂褐素積累水平，每個濃度組處理15條線蟲。

1.7.3 細胞凋亡測定

根據文獻報道的測定方法（周棟，2016），向經不同濃度組暴毒后并清洗完畢的線蟲中加入 1 mL 吖啶橙溶液（25 μg·mL-1），放置于 20 ℃恒溫培養箱培養染色2 h，然后反復清洗3次去除吖啶橙成分。再加入 100 μL 60 μmol·L-1的左旋咪唑溶液，待麻醉1 min后用移液槍吸取適量線蟲于瓊脂糖墊上，于Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡下觀察每組線蟲熒光并捕捉圖像，濾鏡選擇FITC。運用 ImageJ軟件處理計算線蟲的平均熒光強度值，反映線蟲的細胞凋亡水平，每個濃度組處理15條線蟲。

1.8 數據分析

運用統計學軟件SPSS 22.0進行實驗數據統計分析，多組比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析（One-way ANOVA）中的事后多重比較Dunnett test，所有數據均以Mean±SEM的形式表示，P＜0.05認為差異顯著，具有統計學意義。

2 結果

2.1 DEP的組分及表征

由于采樣獲取的柴油機尾氣顆粒（DEP）來源具有不穩定性，對實驗結果有一定的影響，本研究中使用標準參考物質進行分析。SRM2975是柴油機尾氣顆粒的標準參考物質，購自美國國家標準與技術研究院，是從專為柴油動力叉車設計的過濾系統中收集的，其具體組分見標準物質說明書。

利用掃描電子顯微鏡（SEM）對柴油尾氣顆粒進行形貌表征。柴油尾氣顆粒（SRM2975）的檢測結果如圖1所示，SRM2975主要以灰黑色存在，結構近似球形，表面呈現疏松多孔的形貌，易吸附可溶性有機物、重金屬及硫酸鹽等有毒有害物質。

圖1 不同放大尺寸SRM2975的掃描電鏡圖Fig. 1 Representative scanning electron micrographs of SRM2975

2.2 DEP在線蟲體內的分布

DEP慢性暴毒后顆粒物在線蟲體內的分布情況如圖2B所示，與對照組比較，經過高濃度（1 mg·L-1）染毒液10 d的慢性暴毒后，線蟲的咽部和腸道可以明顯觀察到DEP的累積，而低、中濃度組（0.001、0.01、0.1 mg·L-1）的線蟲體內均未觀察到DEP的明顯分布。通過圖2A觀察到，經過亞急性（72 h）暴毒后，DEP在線蟲體內也存在累積情況，主要分布在腸道后部，與慢性暴毒結果相比不明顯。

圖2 柴油機尾氣顆粒在秀麗隱桿線蟲體內的分布情況Fig. 2 Distribution of diesel exhaust particles in C. eleganse

2.3 DEP對秀麗隱桿線蟲生理指標的影響

2.3.1 DEP對線蟲頭部擺動頻率的影響

DEP慢性暴毒對線蟲頭部擺動頻率的影響如圖3所示，經DEP染毒液10 d的慢性暴毒后，與對照組相比，最高濃度組（1 mg·L-1）的線蟲頭部擺動頻率明顯降低 18.8%，有極顯著性差異（P＜0.01），說明DEP對線蟲有神經系統毒害。而低、中濃度組（0.001、0.01、0.1 mg·L-1）對其頭部擺動頻率影響不大，與對照組相比有小幅度上升，不具有顯著性差異。

圖3 DEP對秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率（F）的影響Fig. 3 The effects of DEP on the head swing frequency(F) of C. elegans

2.3.2 DEP對線蟲體長體寬的影響

DEP慢性暴毒對線蟲體長體寬的影響如圖4所示，經DEP染毒液10 d的慢性暴毒后，最高濃度組（1 mg·L-1）的線蟲平均體長為548.1 μm，平均體寬為23.0 μm，與對照組平均體長621.3 μm和體寬25.1 μm相比分別明顯降低了11.8%和8.5%，有極顯著性差異（P＜0.01）。而低、中濃度組（0.001、0.01、0.1 mg·L-1）處理后線蟲的平均體長分別為690.7、658.9、630.2 μm，平均體寬分別為 27.7、27.5、26.5 μm，與對照組相比體長分別上升11.1%、6.0%和1.5%，體寬分別上升10.4%、9.6%和 5.6%，有顯著性差異（P＜0.05）。

圖4 DEP對秀麗隱桿線蟲體長（L）和體寬（W）的影響Fig. 4 The effects of DEP on the body length (L) and width (W) of C. elegans

2.4 DEP對秀麗隱桿線蟲生化指標的影響

2.4.1 DEP對線蟲活性氧自由基水平的影響

DEP慢性暴毒對線蟲體內活性氧自由基水平的影響如圖5所示，經DEP染毒液10 d的慢性暴毒后，與對照組相比，高濃度組（1 mg·L-1）的線蟲體內 ROS水平升高了 10.2%，中濃度組（0.1 mg·L-1）的線蟲ROS水平下降了14.1%，具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.4.2 DEP對線蟲體內脂褐素的影響

DEP慢性暴毒對線蟲體內脂褐素水平的影響如圖5所示，經DEP染毒液10 d的慢性暴毒后，與對照組相比，高濃度組（1 mg·L-1）及中濃度組（0.1 mg·L-1）的線蟲的腸道自發熒光分別增加了6.2%和11.4%，具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.4.3 DEP對線蟲細胞凋亡水平的影響

DEP慢性暴毒對線蟲細胞凋亡水平的影響如圖5所示，經DEP染毒液10 d的慢性暴毒后，與對照組相比，高濃度組（1 mg·L-1）的線蟲細胞凋亡水平上升 1.8%，無顯著性變化，中濃度組（0.1 mg·L-1）下降了 4.4%，具有顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論

本研究利用秀麗隱桿線蟲探究了柴油尾氣顆粒物（DEP）對生物體的慢性毒性效應。通過體視顯微鏡觀察到在經高濃度（1 mg·L-1）染毒液10 d的慢性暴毒后，DEP主要分布在線蟲的咽部和腸道中，但在低、中濃度組的線蟲體內未發現明顯的DEP生物富集現象。根據文獻報道，外源物質通過攝食行為進入線蟲體內，經消化道至排出，停留時間一般不超過6 s。因此初步認定線蟲通過攝食行為將DEP一同攝入體內，在低濃度條件下以及亞急性暴露后，吞食的DEP通過排泄行為及時排出體內，而在高濃度慢性暴露條件下，攝入顆粒過多，超過體內的自凈能力，以致DEP無法正常代謝排出，堆積在咽部和腸道。有研究發現粒徑較大的 GO納米顆粒主要分布在線蟲的咽部和腸道，而顆粒較小的GODs納米顆粒（10—20 nm）分布在線蟲的全身器官（李平，2017）。本實驗中未發現 DEP在除咽部和腸道外的其他器官有富集，可能是因為DEP顆粒大小在20—50 nm之間，無法穿過腸部屏障進入其他部位。此外，DEP也可能很難通過角質層及陰戶等其他方式進入線蟲體內。因此，認為DEP主要是通過線蟲的攝食行為進入其咽部和腸道，并在體內富集，具有產生毒性效應的潛力。

頭部擺動頻率是反映線蟲運動行為的基本指標，而線蟲的運動行為與其神經系統基本功能息息相關，有研究提出秀麗隱桿線蟲的運動行為可以作為秀麗線蟲神經毒性效應的量化指標（Anderson et al.，2004）。線蟲的神經元可按功能分為三類：感覺神經元、運動神經元以及中間神經元，其中運動神經元分別控制不同部位，如頭部、身體的肌肉細胞，感覺神經元將外界刺激轉化為神經沖動后依次傳遞，在信號蛋白的協助下形成突觸，進一步發揮運動神經功能（Loria et al.，2004）。本實驗中高劑量組的DEP對線蟲運動行為的影響可能由于DEP被攝入體內，刺激干擾信號蛋白的正常合成與代謝，進而導致突觸功能與運動神經功能無法正常發揮。而低中濃度組出現的線蟲頭部擺動頻率變化不大甚至小幅度上升的現象可能是微量DEP進入線蟲體內，小幅度刺激其進行覓食等行為，從而導致頭部擺動頻率小幅度升高。本結果提示秀麗隱桿線蟲長期接觸DEP可能造成一定的運動神經損害。

圖5 DEP慢性暴露對秀麗隱桿線蟲生化指標的影響及其代表性熒光圖片Fig. 5 The effect of DEP chronic exposure on the bichemical indicators and its representative fluorescent pictures

體長和體寬是衡量線蟲生長發育情況的重要指標，本實驗結果表明，DEP會降低線蟲的個體發育速率，對其具有生長發育毒性。結合不同劑量的DEP在線蟲體內的分布情況分析，低、中濃度條件下（0.001、0.01、0.1 mg·L-1）未觀察到 DEP在線蟲體內的累積，微量DEP進入線蟲體內可能會對其產生刺激，加速其覓食行為，食物攝取量較對照組增大，從而導致其體長、體寬高于對照組，生長發育優于對照組。而高濃度條件下（1 mg·L-1）DEP顯著富集于咽部和腸道，不僅會影響線蟲的攝食行為導致其食物攝取量變少，積累在腸道的顆粒還可能損害腸壁細胞，影響腸道對營養物質的吸收和貯存，降低線蟲免疫力，導致線蟲生長發育緩慢。Wu et al.（2013）研究發現氧化石墨稀（Graphene oxide）納米顆粒對線蟲腸細胞造成直接損傷，并能損害控制排泄行為的神經元，導致線蟲生長發育緩慢及畸形。在基于其他受試生物如小鼠、斑馬魚等的 DEP毒性研究中也有相似的結論，如Hougaard et al.（2008）發現了DEP會導致小鼠的早期發育緩慢，體重變輕。Wang et al.（2019）以線蟲為模式生物的研究也發現，100 mg·L-1DEP暴露72 h后線蟲的體長與對照組相比顯著下降，與本研究的結果一致。

活性氧自由基（ROS）是反映生物體是否受到氧化損傷的重要指標。當生物體受到外部刺激時，過量的 ROS會使生物體處于氧化應激的狀態，對脂質、蛋白質及DNA等細胞大分子造成損害，是造成細胞凋亡和腸道衰老的重要因素。腸道的自發熒光強度代表著脂褐素溶酶體沉積物水平，是氧化損傷和細胞自噬的產物，可以反映線蟲的衰老程度和體內氧化損傷程度（Yu et al.，2016）。細胞凋亡是生物體為了適應生存環境，受基因調控的細胞主動爭取死亡的過程，具有重要的生物學意義和復雜的分子生物學機制（Vaux et al.，1999），能作為毒理檢測的早期預警指標。本實驗中，低濃度組（0.1 mg·L-1）線蟲體內ROS水平和細胞凋亡水平較對照組均有所降低，而高濃度（1 mg·L-1）的DEP顯著提高了線蟲體內的 ROS水平和細胞凋亡水平。本研究中高濃度組線蟲頭部擺動頻率降低，生長發育受到抑制，與其體內 ROS水平及細胞凋亡程度密不可分。大量文獻表明，正常細胞的過早凋亡會對生物體的生理水平造成負面影響，本研究中線蟲的生理指標和生化指標結果也具有相關性。1 mg·L-1的DEP使線蟲體內的脂褐素水平與對照組相比提高6.2%，而濃度為0.1 mg·L-1的DEP使線蟲體內的脂褐素水平提高了11.4%，表明DEP能夠誘導線蟲腸道的衰老。Yu et al.（2011）研究發現經Al2O3-NPs慢性暴露后線蟲腸道脂褐素的積累主要是由于ROS的大量產生，但在本研究中未發現ROS水平與脂褐素積累的明顯相關性，DEP誘導線蟲腸道老化的機理有待進一步研究。

4 結論

綜上所述，柴油尾氣顆粒物的長期暴露會在秀麗隱桿線蟲體內的富集，影響其運動行為、抑制其生長發育，具有調控線蟲體內的氧化應激和細胞凋亡的作用，并能誘導其腸道老化，具有毒性效應。