猴頭菇液體培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化

李衛(wèi)衛(wèi) 馬 紅 尹永剛

（北京祥云興隆農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，北京102211）

猴頭菇（Hericium erinaceus），以似猴頭的形狀而得名，是一種著名的藥食兩用菌，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1～3]。傳統(tǒng)的猴頭菇生產(chǎn)采用固體二級(jí)種或枝條種，存在制種周期長(zhǎng)，人工成本高，工藝復(fù)雜等問題[4]。隨著猴頭菇工廠化生產(chǎn)的出現(xiàn)和發(fā)展，制種周期短、操作簡(jiǎn)便、易于機(jī)械接種的液體菌種開始被廣泛應(yīng)用[5]。研究表明，液體發(fā)酵產(chǎn)生的菌絲體營(yíng)養(yǎng)成分與子實(shí)體相差不多，甚至有些菌種的菌絲體微量元素含量高于子實(shí)體[6]。研究以工廠化猴頭菇菌株（XYH-1）為對(duì)象，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，找出較為經(jīng)濟(jì)適用的液體培養(yǎng)基的碳源和氮源，測(cè)定不同液體培養(yǎng)基對(duì)菌絲體干重的影響，以及不同玉米粉添加量和不同糖添加量對(duì)發(fā)酵菌絲生物量的影響，為猴頭菇液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)和生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

使用菌種來自北京祥云興隆農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司。

1.2 培養(yǎng)基配方

猴頭菇菌種活化采用PDA 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，土豆汁200 mL，水1 000 mL，pH自然[7]。試管和平板菌種培養(yǎng)也用此培養(yǎng)基。碳源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨0.3%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，pH5.6。氮源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基：白砂糖2.0%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，pH5.6。

1.3 菌種活化培養(yǎng)基制備

用接種針挑取供試菌株母種接種塊，接種于PDA 試管斜面的中間，接種塊大小0.2×0.2×0.2（cm），25℃下培養(yǎng)10天。以復(fù)壯試管為母種接種于PDA平板的中間，接種塊大小0.3×0.3×0.2（cm），25℃下培養(yǎng)10天，搖瓶使用。

1.4 儀器設(shè)備

YXQ-L375S11 型立式壓力蒸汽滅菌器、博訊電熱鼓風(fēng)干燥箱、美的電磁爐、凈化工作臺(tái)（100級(jí)）、HYG-A 全溫?fù)u瓶柜、SH-250 生化培養(yǎng)箱等。

1.5 液體培養(yǎng)菌絲烘干測(cè)重方法

先稱好平板和紗布的重量，再用紗布過濾培養(yǎng)結(jié)束的猴頭菇培養(yǎng)液，將上清液用純化水沖洗2～3 遍，把紗布和菌絲體放在平板上，一起送入電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)于80℃烘干，稱重。另稱取相同重量的紗布烘干后計(jì)算其失水重量。以烘干后總重量減去平板和紗布的重量，再加上紗布失水重量，計(jì)算獲得菌絲體干重，即菌絲生物量。

1.6 猴頭菇液體培養(yǎng)基的碳源篩選

設(shè)5 組試驗(yàn)，分別將2.0%葡萄糖、2.0%白砂糖、2.0%甘薯粉（自制）、2.0%玉米粉、2.0%乳糖等5種碳源添加至碳源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分裝于500 mL 三角瓶中，每瓶分裝200 mL，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。使用高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30 min冷卻至室溫后，用0.6 cm 打孔器對(duì)平板打孔，每瓶接種4個(gè)接種塊，于24.5℃150 r/min 搖床培養(yǎng)8天，測(cè)量菌絲體干重。

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1.7 猴頭菇液體培養(yǎng)基的氮源篩選

設(shè)4 組試驗(yàn)，分別將0.3%豆粕粉、0.3%麩皮粉、0.3%蛋白胨、0.3%酵母粉等4種氮源添加至氮源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分裝于500 mL 錐形瓶中，每瓶分裝200 mL，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。使用高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30 min。冷卻至室溫后，用0.6 cm 打孔器對(duì)平板打孔，每瓶接種4個(gè)接種塊，于24.5℃150 r/min 搖床培養(yǎng)8天，測(cè)量菌絲體干重。

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1.8 液體培養(yǎng)基中玉米粉的添加量試驗(yàn)

設(shè)5 組試驗(yàn)，以1.6%白砂糖、0.3%蛋白胨、0.1%KH2PO4為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加0%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%等5 檔玉米粉含量，分裝于500 mL 錐形瓶中，每瓶分裝200 mL，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。使用高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30 min。冷卻至室溫后，用0.6 cm 打孔器對(duì)平板打孔，每瓶接種4個(gè)接種塊，于24.5℃150 r/min 搖床培養(yǎng)8天，測(cè)量菌絲體干重。、

1.9 液體培養(yǎng)基中糖的添加量試驗(yàn)

設(shè)4 組試驗(yàn)，以0.3%玉米粉、0.3%蛋白胨、0.1%KH2PO4為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加0.8%、1.6%、2.4%、3.2%等4 檔白砂糖含量，分裝于500 mL 三角瓶中，每瓶分裝200 mL，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。使用高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30 min。冷卻至室溫后，用0.6 cm 打孔器對(duì)平板打孔，每瓶接種4個(gè)接種塊，于24.5℃150 r/min 搖床培養(yǎng)8天，測(cè)量菌絲干重。

1.10 猴頭菇液體培養(yǎng)基的配方優(yōu)化

使用篩選的3種碳源、3種氮源，以及無機(jī)鹽、維生素進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1），共9 組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。使用500 mL 三角瓶，每瓶分裝200 mL，采用高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30 min，冷卻后，每瓶接種4個(gè)接種塊，于24.5℃150 r/min搖床培養(yǎng)8天，測(cè)量菌絲干重。

表1 液體培養(yǎng)基試驗(yàn)因素與水平正交設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源的菌絲生物量

由圖1可知，猴頭菇菌絲能夠分解多種碳源，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加2.0%玉米粉的菌絲生物量最高，為4.7 mg/mL，與其他組存在顯著性差異；添加甘薯粉的菌絲生物量次之，為2.3 mg/mL，與其他組存在顯著性差異；再次為白砂糖，菌絲生物量為0.3 mg/mL，與葡萄糖和乳糖之間無顯著性差異。表明玉米粉和甘薯粉是猴頭菇液體發(fā)酵的適宜碳源。

圖1 不同碳源液體培養(yǎng)基的猴頭菇菌絲生物量比較

2.2 不同氮源的菌絲生物量

由圖2可知，酵母粉較有利于猴頭菇菌絲生物量的增加，試驗(yàn)產(chǎn)生的菌絲生物量為3.5 mg/mL；麩皮粉次之，為2.5 mg/mL；豆粕粉位居第三，為2.0 mg/mL。差異顯著性分析的結(jié)果，蛋白胨組的菌絲生物量較低，與酵母、麩皮、豆粕各組之間存在顯著差異。因此，麩皮粉、酵母粉和豆粕粉是猴頭菇菌絲的良好氮源。

圖2 不同氮源液體培養(yǎng)基的猴頭菇菌絲生物量比較

2.3 不同玉米粉添加量的菌絲生物量

菌絲量隨玉米粉添加量的增加而增加（圖3）。其中，1.6%添加量的菌絲生物量最高，為7.9 mg/mL；0.8%添加量次之，為7.1 mg/mL；0.4%和0.2%添加量分別為4.3 mg/mL和3.9 mg/mL；不加玉米粉的最差，僅為0.1 mg/mL，添加0.2%玉米粉是未添加的39 倍。

通過觀察，玉米粉添加量為1.6%的搖瓶培養(yǎng)液通透性較差，推測(cè)玉米粉含量過高較易糊化。因此建議玉米粉添加量不要超過3%。試驗(yàn)中采用白砂糖、葡萄糖、乳糖的通透性雖高，但獲得菌絲體很少；甘薯粉和玉米粉通透性雖差但菌絲量高，推測(cè)因菌絲體的培養(yǎng)需要附著物，玉米粉和甘薯粉140 目為顆粒物，能起到這種作用。試驗(yàn)表明，在1.6%的添加量范圍內(nèi)，玉米粉添加量與菌絲生物量呈正相關(guān)關(guān)系。

圖3 不同玉米粉添加量的猴頭菇菌絲生物量比較

2.4 不同白砂糖添加量的菌絲生物量

由圖4可見，菌絲量隨白砂糖含量增加而增多。添加3.2%的白砂糖，菌絲生物量最高，達(dá)7.5 mg/mL，與其他添加量之間存在顯著差異；2.4%和1.6%添加量，分別為4.8 mg/mL和4.4 mg/mL，差異不顯著；0.8%添加量的菌絲生物量最低，為3.3 mg/mL。說明在相同條件下在3.2%添加量范圍內(nèi)，白砂糖添加量與菌絲生物量呈正相關(guān)關(guān)系。

圖4 不同白砂糖添加量的猴頭菇菌絲生物量比較

2.4 猴頭菇液體培養(yǎng)基的優(yōu)化

正交試驗(yàn)的結(jié)果與猴頭菇液體培養(yǎng)的菌絲體干重見表2。極差R 結(jié)果反映4個(gè)影響因子順序依次為A 碳源>B 氮源>C 無機(jī)鹽>D 維生素。說明碳源和氮源是影響猴頭菇液體發(fā)酵和培養(yǎng)的主要因子。試驗(yàn)中以玉米粉、酵母粉作為猴頭菇液體培養(yǎng)基的碳源和氮源的菌絲生物量較高。通過正交試驗(yàn)，得到猴頭菇液體培養(yǎng)基的最優(yōu)配方組合A3B3C2 D3，即玉米粉2.0%、酵母粉0.3%、KH2PO40.1%、維生素B20.01%。

表2 不同配方液體培養(yǎng)基的猴頭菇菌絲生物量

3 討 論

3.1 液體培養(yǎng)基的碳源和氮源與猴頭菇菌絲體生長(zhǎng)的關(guān)系

猴頭菇培養(yǎng)可以使用多種碳源和氮源，其中復(fù)合碳源（玉米粉和甘薯粉）作為液體培養(yǎng)基碳源的菌絲生物量較高，玉米粉又優(yōu)于甘薯粉。推測(cè)菌絲體的培養(yǎng)需要附著物，玉米粉和甘薯粉可以起到這種作用。培養(yǎng)基中添加部分白砂糖和葡萄糖作為前期的碳源會(huì)更好。

酵母粉、麩皮粉、豆粕粉是猴頭菇液體培養(yǎng)基的良好氮源，培養(yǎng)基中菌球分布均勻，大小一致。這與有機(jī)氮源營(yíng)養(yǎng)豐富，氨基酸種類齊全密切相關(guān)。蛋白胨的菌絲量不如酵母粉、麩皮粉、豆粕粉，這可能與蛋白胨可溶性高，起不到附著物的作用有關(guān)，而酵母粉、麩皮粉、豆粕粉則能起到附著物的作用。

3.2 猴頭菇適宜的液體培養(yǎng)基配方

在培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)中使用正交設(shè)計(jì)，以使組合的各因子之間的關(guān)系均衡分布，保證試驗(yàn)的可比性。正交設(shè)計(jì)可使用較少的組合選擇合適的培養(yǎng)基，是目前篩選培養(yǎng)基常用方法[8]。本試驗(yàn)中，在1.6%玉米粉添加量和3.2%糖添加量范圍內(nèi)，添加量與菌絲體干重呈正相關(guān)關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果確定2.0%玉米粉、0.3%酵母粉、0.1%KH2PO4、維生素B20.01%，是成本較低而菌絲生物量和性價(jià)比均較高的猴頭菇液體培養(yǎng)基配方，可供作猴頭菇子實(shí)體工業(yè)化生產(chǎn)和液體發(fā)酵的深入研究試驗(yàn)配方。