正交試驗優化超聲波輔助提取果蔬中赤霉素GA3殘留量的測定條件

王健，任雪梅，丁曉雯

（1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250102；2.西南大學食品科學學院，重慶400715）

赤霉素GA3（gibberellic acid）又名赤霉酸、九二O、奇寶，是一種生物活性高、應用廣泛的植物激素類農藥。1926 年，日本科學家黑澤英一在研究水稻“惡苗病”時發現感染赤霉菌（Gibberella fujikuroi）的水稻植株會出現瘋長現象，后來經分離鑒定這種活性物質被命名為赤霉素[1-2]。迄今為止，已先后鑒定出136 種結構明確的赤霉素GA1～GA136，其中GA3的生物活性最高、應用最廣泛。赤霉素作為植物生長調節劑已被廣泛應用于農業生產中，在促進細胞分裂和伸長、種子萌發、莖稈伸長、根的生長及開花、果實發育以及提高植物耐逆性等方面發揮著重要作用[3-5]。

國內外研究表明，赤霉素GA3急性毒性較低，對大鼠具有一定的遺傳毒性[6]、神經毒性[7]及生殖毒性[8]，可引起肝臟損傷[9]，甚至誘發腫瘤的形成[10-11]。對于赤霉素GA3的殘留限量問題世界各國未達成一致結論，日本肯定列表規定的赤霉素GA3最高殘留限量（maximum residue limit，MRL）為 0.2 mg/kg[12]，我國還未制定赤霉素的殘留限量標準，因此檢測該物質在農產品與食品中的殘留量，對了解它對農產品的污染情況、保護消費者健康具有積極意義。

目前測定赤霉素的前處理方法主要有液-液萃取[13-14]、固相萃取[15-17]、基質分散固相萃取[18-20]，此外還有超聲波輔助提取[21]、大孔吸附樹脂[22]等方法。部分測定方法前處理操作步驟繁瑣，不適合農殘的快速檢測，而國標方法GB 23200.21-2016《食品安全國家標準水果中赤霉酸殘留量的測定液相色譜-質譜/質譜法》[23]僅適用于水果中赤霉素殘留量的測定。本研究采用超聲波提取-固相萃取-液相色譜法檢測果蔬中赤霉素GA3的殘留量，目的是簡化前處理步驟，提高赤霉素的提取效率，為保障農產品質量安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆芽、梨、蘋果、葡萄、黃瓜：重慶市北碚區A 超市；李子、番茄、黃豆芽：重慶市北碚區B 超市；圣女果、生菜、青椒：重慶市北碚區C 市場。其中單因素試驗、正交試驗、驗證試驗、精密度試驗采用黑豆芽；加標回收試驗、樣品測定采用黃豆芽。

赤霉素GA3標準品（純度95%）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇（分析純）、甲酸（色譜純）：成都市科龍化工試劑廠；甲醇（色譜純）：天津市四友精細化學品有限公司；0.45 μm 有機系微孔濾膜：廣州華載試劑耗材公司；C18固相萃取小柱（3 mL，200 mg）：北京超能傳奇公司。

1.2 儀器設備

LC-20A 型高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）、SHIMADZU C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：日本SHIMADZU 公司；KQ5200DB 型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；HGC-36A 型氮吹儀：天津市恒奧科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 赤霉素GA3標準曲線的繪制

標準溶液的配制：用甲醇作溶劑，配制0.1 mg/mL赤霉素GA3標準儲備液，避光保存于4 ℃冰箱中，有效期3 個月。將赤霉素GA3標準儲備液用甲醇稀釋成濃度依次為 0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100.0 μg/mL 的標準工作液，避光保存于 4 ℃冰箱中，有效期1 個月。

色譜條件[24]：SHIMADZU C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），甲醇-0.15%甲酸水溶液（55 ∶45，體積比）作流動相，流速為0.6 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣量為5.0 μL，檢測波長為 206 nm。

在上述色譜條件下，對各濃度的赤霉素GA3標準工作液進行測定。以赤霉素GA3的濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制赤霉素GA3標準曲線，并求出回歸方程。

1.3.2 樣品的前處理

參照文獻[25]，稱取搗碎后的樣品10 g 左右于100 mL 藍蓋玻瓶中，加入 20 mL 甲醇-水（80 ∶20，體積比）溶液，超聲波提取30 min，布氏漏斗抽濾，取1.0 mL濾液于45℃氮吹至近干，用5%甲醇溶液定容至1.0 mL，過C18固相萃取小柱（小柱使用前分別用1 mL 甲醇和1 mL 純水活化），用 3 mL 甲醇-水（40 ∶60，體積比）洗脫。收集洗脫液于45 ℃氮吹至近干，用甲醇（色譜純）定容至1.0 mL，過0.45 μm 濾膜，供液相色譜分析。通過標準曲線回歸方程查出測定液中赤霉素GA3的濃度，計算樣品中赤霉素GA3的含量。計算公式如下：

式中：X 為樣品中赤霉素的含量，mg/kg；C 為樣品測定液中赤霉素的含量，μg/mL；F 為稀釋倍數；m 為樣品質量，g。

1.3.3 影響樣品前處理的單因素試驗

以黑豆芽作為試驗樣本，根據預試驗結果，選取超聲時間 30 min、超聲功率 160 W、料液比 1 ∶2（g/mL）及甲醇濃度80%為基本條件，改變其中一個條件，固定其他條件以考察這4 個因素對黑豆芽中赤霉素GA3提取量的影響，確定最佳試驗條件。其中超聲時間分別設為 10、20、30、40、50 min，超聲功率分別設為 96、112、128、144、160 W，料液比分別設為 1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5（g/mL），甲醇濃度分別設為 60%、70%、80%、90%、100%。

1.3.4 正交試驗優化

根據單因素試驗結果，對超聲時間、超聲功率、料液比、甲醇濃度這4 個因素進行四因素三水平的正交試驗進一步優化前處理條件，并根據正交試驗得出的優化條件進行驗證試驗。L9（34）正交試驗因素水平表的設置見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and their coded levels used in the orthogonal array design

1.3.5 精密度及加標回收試驗

用正交試驗得到的最優條件對樣品進行提取，提取液重復測定6 次，計算濃度的相對標準偏差即精密度；在所測樣品中加入一定量的赤霉素標準品，計算回收率。

1.3.6 市售果蔬中赤霉素GA3殘留量的檢測

采用正交試驗優化后的樣品前處理條件對梨等5 種水果及番茄等5 種蔬菜中的赤霉素GA3進行提取純化，并利用液相色譜法測定其殘留量。在各樣品中分別添加0.1、0.5、1.0 mg 赤霉素GA3標準品，分別計算低、中、高3 個水平的加標回收率及相對標準偏差。

1.3.7 數據處理

每次試驗均重復操作3 次以上，結果用平均值±標準偏差表示。采用SPSS 16.0 統計軟件進行顯著性分析（最小顯著性差異法）。采用Origin 8.0 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 赤霉素GA3的標準曲線、線性范圍及檢出限

在試驗方法給定的色譜條件下，測定并計算得到赤霉素GA3標準曲線的線性回歸方程為，相關系數r=0.999 8。該標準曲線的線性范圍為0～100 μg/mL，檢出限（S/N=3）為0.5 μg/mL。赤霉素GA3（95%）標準曲線、標準溶液（40 μg/mL）色譜圖分別見圖 1、圖2。

圖1 赤霉素GA3（95%）標準曲線Fig.1 Standard curve of gibberellic acid（95%）

圖2 赤霉素GA3 標準溶液（40 μg/mL）色譜圖Fig.2 Chromatogram of gibberellic acid standard solution（40 μg/mL）

2.2 樣品前處理條件的優化

超聲波輔助提取技術利用超聲效應使提取液充分滲透到樣品勻漿中，具有提取溫度低、耗時短、效率高等特點，適用于各種動、植物有效成分的提取[26]。固相萃取技術利用固體吸附劑對不同組分吸附能力的差異而達到分離待測組分的目的，是一種有效的樣品前處理方法。對于提取劑的選擇，考慮到樣品基質為含水量較多的水果蔬菜，應選擇與水互溶的有機溶劑作為提取劑。參照文獻[25]的試驗結論，60%甲醇溶液提取效果較差，純甲醇提取時易發生乳化現象，因此選用80%甲醇溶液作為提取劑。本試驗采用超聲波提取、固相萃取相結合的方法對豆芽中赤霉素GA3進行提取純化，優化提取條件，以達到更好的提取效果。

2.2.1 超聲時間對赤霉素GA3提取量的影響

稱取一定量搗碎的黑豆芽樣品，加入80%甲醇溶液，于超聲功率 160 W、料液比 1 ∶2（g/mL）的條件下超聲處理不同的時間，然后抽濾、過C18固相萃取小柱，進液相色譜分析，得到不同超聲時間對黑豆芽中赤霉素GA3測定值的影響，試驗結果見圖3。

圖3 超聲時間對赤霉素GA3 提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasound time on the amount of gibberellic acid

由圖3 可以看出，當超聲時間在40 min 以內，赤霉素GA3的提取量增加差異不顯著，當超聲時間超過40 min，赤霉素GA3的提取量與其他時間的提取量存在顯著性差異。結果表明，超聲時間的延長有助于溶劑提取樣品中的赤霉素GA3，但是考慮到省時的原則，超聲時間選擇50 min。

2.2.2 超聲功率對赤霉素GA3提取量的影響

稱取一定量搗碎的黑豆芽樣品加入80%甲醇溶液，在不同的超聲功率下維持料液比1 ∶2（g/mL）、超聲時間30 min 處理樣品，然后抽濾、過C18固相萃取小柱，進液相色譜分析，得到不同超聲功率對黑豆芽中赤霉素GA3測定值的影響，試驗結果見圖4。

圖4 超聲功率對赤霉素GA3 提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the amount of gibberellic acid

由圖4 可以看出，當超聲功率為144 W 時，赤霉素GA3的提取量達到最大值，且128、144 W 的超聲功率對赤霉素GA3的提取量與其他功率相比存在顯著性差異；當超聲功率超過144 W，由于超聲波可能對赤霉素GA3有一定的分解，導致赤霉素GA3的提取量顯著降低。因此，超聲功率選擇144 W。

2.2.3 料液比對赤霉素GA3提取量的影響

稱取一定量搗碎的黑豆芽樣品加入不同體積的80%甲醇溶液，在超聲時間30 min、超聲功率160 W的條件下提取樣品，然后抽濾、過C18固相萃取小柱，進液相色譜分析，得到不同料液比對黑豆芽中赤霉素GA3測定值的影響，試驗結果見圖5。

圖5 料液比對赤霉素GA3 提取量的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the amount of gibberellic acid

由圖 5 可知，當料液比為 1 ∶4（g/mL）時，樣品中赤霉素 GA3的提取量達到最高，且 1 ∶4、1 ∶5（g/mL）的料液比對赤霉素GA3的提取量與其他比例存在顯著性差異。因此，料液比選擇 1 ∶4、1 ∶5（g/mL）較合適。基于少用有機溶劑的原則，選擇料液比為1 ∶4（g/mL）。

2.2.4 甲醇濃度對赤霉素GA3提取量的影響

稱取一定量搗碎的黑豆芽樣品加入不同濃度的甲醇溶液，在超聲時間30 min、超聲功率160 W、料液比 1 ∶2（g/mL）的條件下提取樣品，然后抽濾、過 C18固相萃取小柱，進液相色譜分析，得到不同濃度的甲醇溶液對黑豆芽中赤霉素GA3測定值的影響，試驗結果見圖6。

圖6 甲醇濃度對赤霉素GA3 提取量的影響Fig.6 Effect of methanol concentration on the amount of gibberellic acid

由圖6 可知，當甲醇濃度為80%時，樣品中赤霉素GA3的提取量達到最高，且80%、90%甲醇溶液對樣品中赤霉素GA3的提取量顯著高于其他濃度甲醇溶液。因此，甲醇濃度選擇80%、90%較合適。基于少用有機溶劑的原則，選擇甲醇濃度為80%。

綜合單因素試驗結果，超聲波處理樣品提取赤霉素GA3較適宜的條件是超聲時間50 min、超聲功率144 W、料液比 1 ∶4（g/mL）、甲醇濃度 80%。

2.3 正交試驗確定赤霉素GA3提取的最佳條件

在單因素試驗結果基礎上，根據L9（34）正交試驗因素水平表的設計進行正交試驗，結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal array

極差R 的大小可衡量因素的主次，極差大表明該因素對試驗的產生與結果影響大，即此因素重要；極差小表明該因素較次要。由表2 的極差分析結果可知，各試驗因素對赤霉素GA3測定含量影響的主次順序為B>C>D>A，即超聲功率>料液比>甲醇濃度>超聲時間；最佳提取條件為A1B1C3D3，即超聲時間45 min、超聲功率128 W、料液比1 ∶4.5（g/mL）、甲醇濃度85%。

采用優化后的超聲波提取條件，經固相萃取純化，高效液相色譜法檢測黑豆芽樣品中赤霉素GA3，得到測定值為285.19 mg/kg，明顯高于正交試驗的最優組（第7 組）的208.49 mg/kg。

因此，測定樣品中赤霉素GA3的超聲波提取的最優條件是超聲時間45 min、超聲功率128 W、料液比1 ∶4.5（g/mL）、甲醇濃度 85%。

2.4 方法的精密度和準確度

精密度反映分析方法或測量系統存在的隨機誤差，是衡量方法可靠性的一項重要指標。黑豆芽樣品精密度試驗結果如表3 所示，其中SD 為標準差（standard deviation），RSD 為相對標準偏差（relative standard deviation）。

表3 豆芽樣品精密度試驗結果Table 3 Accuracy test results of bean sprouts

由表3 可知，黑豆芽樣品赤霉素GA3重復測定6次試驗的結果在119.70 mg/kg～130.90 mg/kg 之間，平均值為125.55 mg/kg。因選用不同批次的黑豆芽樣品進行正交試驗及精密度試驗，正交試驗最優組合與精密度實驗中赤霉素GA3的測定結果不具有可比性。

相對標準偏差（RSD）越接近0%，表示該方法的精密度越好。由表3 可知，黑豆芽中赤霉素提取量的相對標準偏差為2.99%，表明該方法在重復性條件下（n=6）精密度良好。

準確度是反映分析方法或測定系統存在的系統誤差和隨機誤差的綜合指標，通常用加標回收率作為評價指標。黃豆芽中赤霉素3 個水平的加標回收率如表4 所示。

表4 豆芽中赤霉素GA3 的加標回收率Table 4 Recovery rate of gibberellic acid in bean sprouts

回收率越接近100%，表示該方法的準確度越高。從表 4 可知，添加 0.1、0.5、1.0 mg 赤霉素標準品，加標回收率分別為96.04%、97.05%、94.69%，相對標準偏差分別為4.22%、6.61%、4.65%，表明該方法的準確度良好。

歐盟對食品中農藥殘留測定方法作了嚴格規定，回收率為70%～120%，相對標準偏差不超過20%[27]。經驗證，本研究所建立的赤霉素殘留檢測方法的回收率及相對標準偏差均在相關標準規定范圍內，證明該方法的精密度及準確度良好，符合分析檢測的要求。

2.5 市售果蔬中赤霉素GA3殘留檢測結果

隨機購買3 個市場的10 種果蔬樣品，采用優化后的超聲波提取條件處理樣本，經C18固相萃取小柱凈化，高效液相色譜法測定，得到樣本中赤霉素GA3含量及3 個水平的加標回收率，結果見表5。

由表5 可知，測定的黃豆芽中赤霉素殘留量高達21.56 mg/kg，梨、圣女果、蘋果、黃瓜樣品中的殘留量分別為 5.25、4.94、4.57、3.89 mg/kg，其余樣品未檢出。測定結果表明，芽菜類和早熟果蔬中GA3殘留情況嚴重，與史玉琴[28]的結論一致。

表5 市售果蔬中GA3 殘留量Table 5 Residues of gibberellic acid in commercially available fruits and vegetables

由于我國未出臺赤霉素GA3的限量標準，如果套用日本肯定列表規定的殘留限量0.2 mg/kg，所檢測的10 種樣品中50%陽性檢出均遠遠超過了0.2 mg/kg，其中黃豆芽中的赤霉素GA3含量超過日本肯定列表的限量規定100 倍。造成赤霉素GA3殘留量過高的原因可能與不規范使用有關，相關部門應該加強對農產品中赤霉素GA3規范使用的管理及殘留量的檢測。

采用本研究所建立的超聲波輔助提取-固相萃取-高效液相色譜法測定10 種果蔬樣本赤霉素殘留量，3 個不同添加水平（0.1、0.5、1.0 mg） 的回收率在79.36%～97.05%之間，相對標準偏差為2.63%～9.99%。根據歐盟及我國相關規定，該方法的精密度及準確度良好，符合檢測的技術要求，可以作為果蔬樣本中赤霉素殘留量的測定方法。

3 結論

采用超聲波提取樣品中的赤霉素GA3，最優的實驗條件為超聲時間45 min、超聲功率128 W、料液比1 ∶4.5（g/mL）、甲醇濃度85%。超聲波提取不僅簡化了前處理過程，大大縮短了分析時間，而且測定的加標回收率為79.36%～97.05%，相對標準偏差為2.63%～9.99%。本研究所建立的前處理方法符合簡便、快速、準確、靈敏的農藥殘留檢測要求，適用于多種果蔬中赤霉素的殘留檢測。