副干酪乳桿菌VL8胞外多糖對巨噬細胞RAW264.7免疫激活作用研究

李琪，杜佳峰，高潔，劉曉宇，王向紅，桑亞新

（河北農業大學食品科技學院，河北保定071001）

巨噬細胞是一類由單核細胞分化而來、具有防衛作用的免疫細胞[1]。巨噬細胞以不同形式廣泛分布于機體不同組織中，其不但參與機體的特異性免疫反應和非特異性免疫反應，而且是兩種免疫反應聯系的“橋梁細胞”[2]。巨噬細胞膜上的非特異性受體－外源性凝集素B 為糖蛋白，通過其終端的-OH 基與多糖-H基結合，啟動了細胞內環化酶系統，致使細胞內酶的分泌及活性增加，細胞代謝提高，從而奠定了巨噬細胞活化的基礎[3]?；罨木奘杉毎哂卸ㄏ蜻\動和吞噬功能，能夠吞噬外來異物或直接殺死病原體和腫瘤細胞，還能分泌多種活性物質（如活性氧（reactive oxygen species，ROS）、NO 和細胞因子等）來參與機體的免疫應答等，同時還能夠傳遞抗原[4-5]。這些均與細胞內酶的活性有關。

天然多糖主要來源于細菌、真菌、藻類和高等植物等組織中，具有復雜的結構和多種生物活性，如免疫調節，抗腫瘤，抗炎癥，抗病毒即抗氧化等，是一種有效的生物應答調節劑[6-7]。越來越多的藥理和臨床研究表明，多糖作為藥物，其細胞毒性較小，并且可激活巨噬細胞的免疫反應。近年來微生物來源的胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）逐漸取代了傳統的植物多糖而越來越受到人們重視。微生物多糖由于其生產周期短，不受季節、氣溫等條件限制，具有較強的市場競爭力和廣闊的發展前景[8]。國內外大量研究表明，乳酸菌EPS 具有一定的免疫調節活性，既能激活非特異性免疫中的巨噬細胞和NK 細胞等免疫細胞，提高機體免疫分子的分泌能力；又能作用于特異性免疫系統，激活T 淋巴細胞產生淋巴因子，刺激B 淋巴細胞產生抗體等。但是，由于乳酸菌胞外多糖結構的復雜性和來源的廣泛性，在機理上是如何發揮免疫調節作用依然不清楚。由于乳酸菌EPS 具有菌株特異性，不同菌株產生的EPS 差異性很大，不同的EPS 具有各自特定的功能，因此在對新分離的乳酸菌EPS 的功能篩選時，對其進行免疫活性的研究是很有必要的[9-10]。

Viili 是一種源自于芬蘭的傳統發酵乳制品，有研究表明Viili 黏稠性是由其中乳酸菌產生的胞外多糖所致[11]。Viili 中的這種胞外多糖具有降低血液膽固醇含量、抗腫瘤及促進益生菌與腸粘膜的吸附等重要的生理活性[12]。多糖對巨噬細胞的基本作用就是刺激巨噬細胞，使其活力增強，提高胞內酶活力，并釋放多種活性物質。本試驗以副干酪乳桿菌VL8 胞外多糖（VL8-EPS） 為研究對象，研究其對巨噬細胞RAW264.7 胞內酶（SOD、iNOS）及活性氧（H2O2、O2-）的影響，初步探討VL8-EPS 對巨噬細胞的激活機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細胞株：國家實驗細胞資源共享服務平臺，小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7，此細胞株源自BALB/c 小鼠由Abelson 鼠科白血病病毒誘導的腫瘤。

VL8-EPS 實驗室制備；DMEM 培養基、迪夫快速染色液（Diff-Quik Stain）試劑盒、超氧陰離子（oxygen free radical，OFR）含量檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、過氧化氫（H2O2）測試盒、一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，NOS）試劑盒：南京建成生物工程研究所；細胞蛋白抽提與BCA 蛋白定量試劑盒：北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2004 電子天平：上海舜宇有限公司；CO2培養箱CB160：Binder 公司；1500-823 型酶標儀：Thermo Sci entific 公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；YS100 顯微鏡：Nikon 儀器公司；Feb-80 電動離心機：天津市華北實驗儀器有限公司；K5600型超微量分光光度計：北京凱奧科技發展有限公司（KAIAO）。

1.3 方法

1.3.1 RAW264.7 細胞活化與培養

將細胞凍存管從液氮罐中取出，迅速在37 ℃恒溫水浴鍋中進行解凍。然后于超凈臺無菌操作，將細胞及凍存液轉移到含有5 mL 高糖DMEM 培養液的離心管中，1 000 r/min 離心 3 min～5 min，輕輕棄掉上清，保留離心管底的細胞，再用含有10 % 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM 培養液重懸細胞，最后，將細胞懸液置于細胞培養瓶中37 ℃、5%CO2的條件下培養。

1.3.2 VL8-EPS 對RAW264.7 細胞形態的影響

將 RAW264.7 細胞按 5×105個/mL 接種在 12 孔板中，試驗分為空白對照組（不加VL8-EPS 和LPS），VL8-EPS 處理組（終濃度分別為 50、200、400、800 μg/mL），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）陽性對照組（終濃度為 10 μg/mL），于 37 ℃、5%CO2培養箱中 24 h 后棄上清，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3 次。用500 μL Diff-Quik 固定劑固定細胞20 s，之后用 500 μL Diff-QuikⅠ染色 5 s～10 s，然后用 500 μL Diff-QuikⅡ染色10 s～20 s。最后，用PBS 洗滌后，趁濕在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.3 VL8-EPS 對RAW264.7 細胞iNOS 酶活力的影響

將 RAW264.7 細胞按 5×105個/mL，加入 6 孔板中，每孔2 mL。試驗分為空白對照組（不加VL8-EPS和 LPS），VL8-EPS 處理組 （終濃度分別為 50、100、200、400、800 μg/mL），LPS 陽性對照組 （終濃度為10 μg/mL），于 37 ℃、5 % CO2培養箱中 24 h 后棄上清，PBS 洗滌 3 次，每孔加 200 μL RIPA 裂解液，于冰上孵育20 min，使細胞充分裂解。離心取上清，蛋白質定量（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度后，根據一氧化氮合酶測定試劑盒說明書測定iNOS 酶活力。

1.3.4 VL8-EPS 對 RAW264.7 細胞 SOD 酶活力的影響

將 RAW264.7 細胞按 5×105個/mL，加入 6 孔板中，每孔2 mL。試驗分為空白對照組（不加VL8-EPS和 LPS），VL8-EPS 處理組 （終濃度分別為 50、100、200、400、800 μg/mL），LPS 陽性對照組 （終濃度為10 μg/mL），于 37 ℃、5 % CO2培養箱中 24 h 后棄上清，PBS 洗滌 3 次，每孔加 200 μL RIPA 裂解液，于冰上孵育20 min，使細胞充分裂解。離心取上清，BCA 法測定蛋白濃度后，根據超氧化物歧化酶測定試劑盒說明書測定SOD 酶活力。

1.3.5 VL8-EPS 對 RAW264.7 細胞分泌 O2-的影響

將 RAW264.7 細胞按 5×105個/mL，加入 96 孔板中，每孔100 μL。試驗分為空白對照組（不加VL8-EPS和 LPS），VL8-EPS 處理組 （終濃度分別為 50、100、200、400、800 μg/mL），LPS 陽性對照組 （終濃度為10 μg/mL），每組設置 6 個重復，于 37 ℃、5%CO2培養箱中24 h 后，取細胞培養液，按照超氧陰離子含量檢測試劑盒說明書添加試劑，混勻，8 000 r/min，25 ℃，離心 5 min，小心吸去上層水相 200 μL，530 nm 處測定吸光值，根據標準曲線計算O2-的含量。

1.3.6 VL8-EPS 對 RAW264.7 細胞分泌 H2O2的影響

將 RAW264.7 細胞按 5×105個/mL，加入 24 孔板中，每孔1mL。試驗分為空白對照組（不加VL8-EPS 和LPS），VL8-EPS 處理組（終濃度分別為 50、100、200、400、800 μg/mL），LPS 陽性對照組（終濃度為 10 μg/mL），每組設置 3 個重復，于 37 ℃、5%CO2培養箱中 24 h 后，取上清液，按照過氧化氫測試盒說明書測定H2O2的含量。

1.3.7 統計分析

試驗數據均由SPSS 17.0 進行分析，結果以平均數±標準差（X±SD）表示。各組求平均值后，兩兩對比，進行單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 VL8-EPS對RAW264.7細胞形態的影響

使用Diff-Quik 染色試劑盒觀察細胞的形態，結果如圖1 所示。

圖 1 VL8-EPS 對 RAW264.7 細胞形態的影響（200×）Fig.1 Effect of VL8-EPS on RAW264.7 cells morphologic（200×）

從圖1 中可以看出，在空白對照組中，未激活的RAW264.7 細胞大多呈圓形。與空白對照組相比，VL8-EPS 處理的細胞出現明顯的形態變化，開始出現不規則多邊形。與陽性對照LPS 組相似，一些細胞延伸顯示典型活躍狀態的偽足，濃度較高，巨噬細胞顯得更長，更多角形。結果表明VL8-EPS 具有與LPS 相似的功能，能夠改變巨噬細胞形態，激活細胞。但變形比例明顯小于LPS 組。

2.2 VL8-EPS對RAW264.7細胞iNOS酶活力的影響

VL8-EPS 對RAW264.7 細胞iNOS 酶活力的影響如圖2 所示。

圖2 VL8-EPS 對RAW264.7 細胞iNOS 酶活力的影響Fig.2 Effect of VL8-EPS on the activity of iNOS in RAW264.7 cell

由圖2 可知，不同濃度的VL8-EPS 均能夠提高RAW264.7 細胞iNOS 酶活力，其活力顯著高于空白對照組（P＜0.01），并且隨著 VL8-EPS 濃度的增大，iNOS酶活力提高，具有一定的量效關系。在800 μg/mL 時，其酶活力達到25.80 U/mgprot，較空白對照組提高了104.64%，且顯著高于陽性對照 LPS 組（P＜0.01）。結果表明，VL8-EPS 在 50 μg/mL～800 μg/mL 濃度范圍內，能夠激活巨噬細胞，促進細胞iNOS 酶活力增加。

2.3 VL8-EPS對RAW264.7細胞SOD酶活力的影響

VL8-EPS 對RAW264.7 細胞SOD 酶活力的影響如圖3 所示。

圖3 VL8-EPS 對RAW264.7 細胞SOD 酶活力的影響Fig.3 Effect of VL8-EPS on the activity of SOD in RAW264.7 cell

由圖3 可知，與空白對照組相比，不同濃度的VL8-EPS 均能提高RAW264.7 細胞SOD 酶活力，其中濃度達到 200 μg/mL 后達到極顯著差異（P＜0.01），且SOD 酶活力隨著VL8-EPS 濃度的增加而增加，呈現出一定的量效關系。其結果與LPS 組類似，并在濃度為800 μg/mL 時，SOD 酶活力達到 7.44 U/mgprot，較空白對照組提高了10.30 %，且高于LPS 組。結果說明VL8-EPS 在 50 μg/mL～800 μg/mL 濃度范圍內，可以激活巨噬細胞，提高SOD 酶活力。

2.4 VL8-EPS對RAW264.7細胞分泌O2-的影響

VL8-EPS 對RAW264.7 細胞分泌O2-的影響如圖4 所示。

如圖4 所示，與空白對照組相比，除50 μg/mL 濃度外，其余各組濃度的VL8-EPS 均極顯著提高了巨噬細胞分泌 O2-水平（P＜0.01），并隨著濃度的增大，O2-分泌量增加，呈一定的量效關系。在800 μg/mL 時，O2-含量最高，較空白對照組提高了666.87%，但其分泌量遠低于陽性對照LPS 組。結果表明，VL8-EPS 能夠激活巨噬細胞，在 50 μg/mL～800 μg/mL 濃度范圍內能夠促進巨噬細胞分泌O2-。

圖4 VL8-EPS 對RAW264.7 細胞分泌O2-的影響Fig.4 Effect of VL8-EPS on O2-secretion in RAW264.7 cell

2.5 VL8-EPS對RAW264.7細胞分泌H2O2的影響

VL8-EPS 對RAW264.7 細胞分泌H2O2的影響如圖5 所示。

圖5 VL8-EPS 對RAW264.7 細胞分泌H2O2 的影響Fig.5 Effect of VL8-EPS on H2O2 secretion in RAW264.7 cell

由圖5 可知，與空白對照組相比，不同濃度的VL8-EPS 均能顯著促進巨噬細胞釋放H2O2（P＜0.05，P＜0.01），隨著多糖濃度的增加，H2O2釋放量增加，具有一定的量效關系。其中，在最大多糖濃度時，其分泌量達到了16.00 mmol/L，較空白對照組提高了81.78%，并且高于陽性對照LPS 組。結果表明，VL8-EPS 在50 μg/mL～800 μg/mL 濃度范圍內，能夠促進巨噬細胞分泌H2O2活性氧，起到殺滅病原微生物的作用。

3 討論

巨噬細胞是機體免疫系統中的重要成分之一，作為免疫效應細胞起作用，廣泛參與免疫系統的調節。人體內抗微生物和寄生蟲感染的主要效應細胞是巨噬細胞[13-14]。不少研究表明活化后的巨噬細胞在吞噬異物的過程中會釋放大量釋放多種免疫活性物質，如溶菌酶，髓過氧化物酶，乳鐵蛋白，防御素，活性氧物質，活性氮物質等，以其清除異物[15-16]。

研究表明，當巨噬細胞受到外界物質的刺激后，形態會發生改變，增加細胞表面積，提高吞噬能力[17-18]。本研究發現，添加VL8-EPS 的RAW264.7 細胞經過一段時間的共培養，其細胞形態發生明顯變化。表現為圓形、橢圓、菱形、梭形或者不規則形，還可見較長的偽足。沒添加藥物不被激活的細胞一般呈圓形、橢圓形，很少見有突起。表明VL8-EPS 能夠活化巨噬細胞，促進其形態變化。同時，激活的巨噬細胞能明顯提高巨噬細胞胞內酶的活性。NO 是活化巨噬細胞殺傷腫瘤細胞和病原微生物的一個重要效應分子，激活的巨噬細胞表達NO 合成酶（NOS），利用L-精氨酸合成NO[19]。作為NO 合成中的關鍵酶，NOS 調節和影響生物活性。目前，有 3 種 NOS 亞型稱為神經元 NOS（nNOS），內皮NOS（eNOS）和誘導型 NOS（iNOS）。nNOS 和 eNOS 在細胞的生理狀態中表達，其是Ca2+依賴性的。然而，iNOS 主要存在于巨噬細胞中，并且被認為在被非Ca2+依賴性的細胞因子刺激后不表達。SOD 作為體內抗氧化酶系統的主要成分，體內高水平的氧自由基主要來源于免疫和炎癥過程。SOD 是機體代謝的關鍵酶，它能催化體內分子氧活化的第一個中間產物超氧陰離子自由基（O2-·）的歧化反應而形成氧分子和過氧化氫。這些生成物對細胞仍會造成損害，可被過氧化氫酶及硒谷胱甘肽過氧化物酶等酶進一步無毒化[20]。生成的O2-和H2O2等活性氧成分是殺滅入侵病原微生物的主要成分[21]。陳偉珠[22]研究發現豬茯苓多糖能夠提高巨噬細胞iNOS 活性。程安瑋[23]發現甘草多糖可以激活巨噬細胞，提高SOD，iNOS 酶活力，促進巨噬細胞釋放O2-。徐智敏[24]發現L.casei 胞外多糖能夠提高巨噬細胞O2-和H2O2水平。本試驗研究結果發現，VL8-EPS 促進巨噬細胞形態改變，提高了iNOS、SOD 的活性，同時促進釋放O2-和H2O2活性氧，激活了巨噬細胞。結果說明VL8-EPS 作為一種食品級來源的活性多糖，對巨噬細胞無明顯毒副作用，并且能夠激活巨噬細胞分泌活性物質，提高免疫調節能力，是理想的天然免疫佐劑。本研究結果與程安瑋[23]，徐智敏[24]等的結果一致。

4 結論

VL8-EPS 能夠激活RAW264.7 細胞，促使細胞形態學發生改變，提高巨噬細胞胞內酶iNOS 及SOD 酶活力，同時促進細胞分泌O2-和H2O2活性氧。由此表明，VL8-EPS 可能是通過促進巨噬細胞胞內酶活力及分泌活性氧來發揮免疫調節作用，提示VL8-EPS 可以作為一種潛在免疫調節劑激活巨噬細胞，發揮免疫增強功能。關于VL8-EPS 對巨噬細胞免疫功能的影響機制有待于進一步研究。