超聲輔助低共熔溶劑法提取葡萄皮中殘留農藥

陳素娥，劉亮亮，趙龍山，朱琳，*

（1.山西衛生健康職業學院，山西晉中030619；2.沈陽藥科大學，遼寧沈陽110016）

葡萄的營養價值較高且在全世界范圍內的種植面積和產量均位居前列，其果實中含有人體不可或缺的維生素、礦物質、核黃素、硫胺素等[1]，具有生津消食、緩解疲勞、補血益氣、延年益壽的功效[2-3]。隨著人們對葡萄營養價值認識的逐漸增多和對葡萄需求的日漸增大，葡萄中的農藥殘留量也逐步被人們重視。文獻中報道的葡萄上的殘留農藥主要有甲霜靈、多菌靈、吡蟲啉等[4]。這些農藥在葡萄上的殘留時間較長且具有一定的毒性。人體食用葡萄后，葡萄上的殘留農藥也同時被攝入人體內，對人體造成一定的損害，因此有必要對葡萄上的農藥殘留進行檢測。

樣品前處理對于其含量測定至關重要。好的前處理方法操作簡便，試驗試劑易獲取，且處理后的樣品溶液雜質較少，對待測峰的影響小[5]。目前，農藥殘留的前處理通常采用液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、固相萃取（solid-phase extraction，SPE）和基質固相分散萃取（matrix solid phase dispersion extraction，MSPDE）等，但這些方法存在有機試劑用量大，容易乳化，價格昂貴，提取效率低以及操作復雜，重現性較差等問題[6-8]。就提取方式而言，目前對果蔬中農藥殘留的提取方法一般有浸泡法、超聲提取法、微波提取法、超臨界流體萃取等。其中超聲提取具有提取所需時間短，提取效率高的優點[9-10]。

低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs） 由 Leicester 大學的Abbott 等首次提出，通常是由氫鍵受體（如季銨鹽等有機鹽）和氫鍵供體（如醇、羧酸、酰胺等）通過氫鍵橋聯作用連接而成的穩定溶劑[11-13]。由于其綠色環保，環境友好，制備簡單的特點，DESs 在分析研究中得到了迅速發展[14-17]，如植物中的生物活性成分的提取[18-19]，重金屬的生物樣品的提取[20]等。而目前尚無太多應用低共熔溶劑進行果蔬中農藥殘留提取的研究。本試驗選擇葡萄皮作為樣品，低共熔溶劑作為提取劑，液液萃取作為提取方法，結合高效液相色譜法，對葡萄皮中的農藥進行了提取、測定和優化。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

Agilent LC 1100 液相色譜儀：美國Agilent 公司；AL104 電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ5200 超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LC-400 低速離心機：科大創新股份有限公司中佳分公司；JP200-24 干式氮吹儀：上海旌派儀器有限公司；ACO-003 電磁式空氣泵：森森集團股份有限公司；GM-0.33A 隔膜空氣泵：天津市津騰實驗設備有限公司；LyoQuest-55 冷凍干燥機：西班牙泰事達。

1.2 試劑

GBW（E）082341 多菌靈、CW：LC-321 吡蟲啉：壇墨質檢-標準物質中心；甲霜靈：山東濰坊潤豐化工股份有限公司；甲醇、乙腈（色譜級）、鹽酸（分析級）：山東禹王實業有限公司化工分公司；磷酸（分析級）：天津市光復精細化工研究所；二氯甲烷、石油醚、乙二醇（分析級）：天津市富宇精細化工有限公司；氫氧化鈉、分析級丙三醇、苯酚（分析級）：天津市恒興化學試劑制造有限公司；氯化膽堿（分析級，ChCl）：北京百靈威科技有限公司；葡萄糖（分析級）：天津市大茂化學試劑廠；乳酸（分析級）：天津市博迪化工股份有限公司。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：280 nm 和210 nm，進樣量：20 μL，流動相：甲醇（A）-0.05% 磷酸水溶液（B），梯度洗脫條件：0～5 min，10～60（A），5 min～18 min，60～86（A）。

2.2 標準溶液的配制

分別精密量取對照品溶液多菌靈（100 μg/mL）、吡蟲啉（100 μg/mL）一定體積，配制成 10 μg/mL 的標準儲備液。精密稱取甲霜靈對照品0.01 g 置于50 mL 容量瓶中，配制成200 μg/mL 的標準儲備液。將標準儲備液均置于-20 ℃環境下密封保存。

2.3 加熱法制備低共熔溶劑

將氫受體和氫供體按照一定的摩爾比準確稱量后，在一定溫度下（如表1）攪拌加熱約2 h～4 h，直至形成穩定、均一、透亮的溶液，然后冷卻至（20±5）℃即得。具體條件見表1。

表1 加熱法制備低共熔溶劑Table 1 Preparation of eutectic solvent by heating

2.4 樣品溶液的制備

將從沈陽站附近中興超市中興店購買的葡萄剝皮，將葡萄皮攪碎后置于圓底燒瓶中，置于冷凍干燥機中凍干后（20±5）℃保存，用天平準確稱量葡萄皮粉末約 0.1 g，加入 2 mL 提取劑（ChCl-丙三醇=1 ∶4/mol ∶mol），加入多菌靈、吡蟲啉、甲霜靈標準儲備液各100 μL，超聲提取30 min 后，在4 000 r/min 條件下離心5 min，取1 mL 上清液置于離心管中，加入1 mL 石油醚除雜，4 000 r/min 條件下離心5 min，取提取液層，用2 mL 二氯甲烷分2 次萃取提取液，合并二氯甲烷層，氮吹至干，0.5 mL 甲醇定容，過 0.45 μm 濾膜待測。

2.5 低共熔溶劑體系的選擇

按2.4 項下制備方法制備空白和加標兩組樣品溶液，分別考察 ChCl-苯酚（1 ∶4/mol ∶mol）、ChCl-乳酸（1 ∶2/mol ∶mol）、ChCl-葡萄糖（1 ∶1/mol ∶mol）、ChCl-丙三醇（1 ∶4/mol ∶mol）提取劑對色譜峰形和相應的影響。

2.6 中心組合設計響應面優化

前期研究發現，對多菌靈、吡蟲啉、甲霜靈的提取檢測影響比較顯著的3 個因素是：超聲時間（A）、提取劑的用量（B）和 pH 值（C），對這 3 個因素進行 CCD 響應面優化試驗，選用2.5 中對色譜峰形和響應均較好的低共熔溶劑作為提取劑，進行優化。A、B、C 是獨立變量，3 個農藥的總峰面積作為響應變量，共19 個試驗組別，設計如表2。

表2 響應面優化組別Table 2 Experiment DES sign of response surface methodology

2.7 模型驗證

按響應面分析得到優選提取工藝，平行3 次試驗。按照2.4 項下樣品溶液制備方法制備樣品溶液，再按照2.1 項下色譜條件進樣分析，計算3 個農藥成分的總峰面積。

2.8 最優條件下溶劑體系的選擇

選擇不同的溶劑作為提取劑，如表3 所示，按2.4項下制備方法制備樣品溶液，在響應面優化下的最佳條件進行試驗，按照2.1 項下色譜條件進樣分析，計算3 個農藥成分的總峰面積。

表3 最優條件下溶劑體系的選擇Table 3 Selection of solvent system under optimal conditions

3 結果與分析

3.1 色譜條件的優化

檢測波長的選擇：通過查閱文獻發現，多菌靈和吡蟲啉在280 nm 處有較大吸收，而甲霜靈在210 nm左右有最大吸收，多菌靈和吡蟲啉雖在210 nm 處也有吸收，但由于210 nm 處末端吸收較多，雜質峰較多，故選擇雙波長檢測。

流動相的選擇：將標準溶液在流動相為甲醇-水和乙腈-水的條件下分別進樣，發現同樣的方法下選用乙腈-水時，多菌靈和吡蟲啉的峰間隔很小，達不到分離度的要求，經過梯度的調整仍無法分離，故選擇甲醇-0.05%磷酸水溶液作為流動相，在此條件下3 種農藥達到很好的基線分離，且峰形較好，分離度達到1.5 以上。

梯度的選擇：在上述梯度條件下多菌靈在約7.1 min 處出峰，吡蟲啉在約8.9 min 處出峰，甲霜靈在約13.5 min 處出峰。經過嘗試將吡蟲啉至甲霜靈處時間縮短或者將甲霜靈出峰時間后的時間截去，會出現甲霜靈分裂成幾個峰的現象，故仍選擇上述梯度條件進行測定。

3.2 方法學驗證

本文的方法學驗證主要由線性、回收率組成。

3.2.1 線性范圍

取制備好的多菌靈、吡蟲啉儲備液，分別配制成0.1、0.5、1、2、5、10 μg/mL 的標準溶液；取制備好的甲霜靈儲備液，配制成 0.5、1、5、10、20、50 μg/mL 的標準溶液。每種農藥的每個濃度配制3 份溶液進行測定，取峰面積的平均值，分別繪制標準曲線，以峰面積的平均值為縱坐標，濃度為橫坐標，分別做出標準曲線方程，如表4 所示。3 種農藥在考察范圍內濃度與色譜峰面積呈現良好的線性關系。

表4 標準物質回歸數據Table 4 The linear range of pestici DESs

3.2.2 回收率測定

精密稱取待測物，隨機分為3 組，每組分別精密加入低、中、高濃度的對照品溶液，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜方法測定多菌靈、吡蟲啉和甲霜靈3 種農藥成分的含量，計算加樣回收率。不同提取劑提取后的加樣回收率結果如表5 所示。

表5 回收率測定結果Table 5 The recovery of pestici DESs

由表5 可知，各物質的加樣回收率在60%～112%之間，當溶劑為 ChCl-甘油（1∶4/mol∶mol）和 ChCl-乙二醇（1∶2/mol∶mol）等比例混合時，3 種農藥成分的回收率最高。

3.3 低共熔溶劑體系的選擇

通過試驗發現：在 ChCl-苯酚（1∶4/mol∶mol）、ChCl-乳酸（1∶2/mol∶mol）、ChCl-葡萄糖（1∶1/mol∶mol）、ChCl-丙三醇（1∶4/mol∶mol）低共熔溶劑提取葡萄皮樣品的色譜圖中，ChCl 和醇類物質組成的低共熔溶劑提取的峰的峰形和響應度均較好，故選擇ChCl-丙三醇（1∶4/mol∶mol）作為提取劑進行條件優化。

3.4 響應面優化結果

前期研究表明多菌靈、吡蟲啉、甲霜靈的提取檢測影響比較顯著的3 個因素是：超聲時間、提取劑的用量和pH 值，對這3 個因素進行響應面優化試驗，結果如表6。

表6 方差統計分析結果Table 6 The results of variance analysis

由表 6 可知，模型高度顯著（F=7.77，P ＜ 0.05），失擬項很小（F=4.73），可以看出這是有效的模型建立，因此試驗方法可靠，可以用該模型對葡萄皮的提取率進行預測。

為了更直觀的觀察各因素間的相互作用，以3 種農藥總峰面積和評價指標進行設計，利用Design-Expert 軟件對結果做出響應曲面圖，結果見圖1。

圖1 葡萄皮中3 種農藥總峰面積和評價指標的響應面分析圖Fig.1 Response surface plots of the model for total peak area of carbendazim，imidacloprid and metalaxyl in grape skin samples

從圖1 可知，最優的提取條件為超聲時間30 min、DESs 用量為 2 mL、pH=5。

3.5 模型驗證結果

為驗證模型，在最優條件下進行3 次平行試驗，3 次試驗的總峰面積結果為：2 325.4、2 706、2 730.8。這與預測范圍2 211.53 至4 367.75 相符合，這說明了該模型的建立是合理的。預測結果與實際值的比較如圖2，殘差法線圖如圖3。

3.6 最優條件下低共熔溶劑體系的選擇

圖2 預測值和實際值的比較Fig.2 Comparison of predicted and actual values

圖3 殘差法線圖Fig.3 Normal plot of residuals

通過考察 ChCl-丙三醇（1∶4/mol∶mol）、ChCl-乙二醇（1∶2/mol∶mol）、ChCl-1，4 丁二醇（1∶4/mol∶mol）、ChCl-丙二醇（1∶3/mol∶mol）、ChCl-丙三醇（1∶4/mol∶mol）+ChCl-乙二醇 （1∶2/mol∶mol）、ChCl-丙三醇 （1∶4/mol∶mol）+ChCl-1，4 丁二醇（1∶4/mol∶mol）、甲醇、乙腈 8 種低共熔溶劑體系發現，在相同條件下，ChCl-乙二醇（1∶2/mol∶mol）和 ChCl-丙三醇（1∶4/mol∶mol）等體積混合時對多菌靈、吡蟲啉、甲霜靈3 種農藥的提取效率最高（回收率結果見表5），且分離度和峰形均較好。典型色譜圖如圖4。

4 結論

本研究首次建立了超聲輔助低共熔溶劑結合液液萃取技術提取葡萄皮中甲霜靈、吡蟲啉、多菌靈3 種農藥的方法。該方法簡單，生產成本低、提取速度快、效率高，且綠色環保，為果蔬及其他農產品的農藥殘留的提取提供了新方法。同時DESs 作為一種新型綠色萃取溶劑，具有合成工藝簡單、生物降解性好、毒性小、穩定性高等優點，有望成為更多領域的研究熱點。