替芬泰片在健康人體的耐受性及藥代動力學分析

梁 弘 李 潔 吳玉春 程 楠 陳華容 吳貴輝

貴州百靈企業集團制藥股份有限公司學術研發部，貴州安順 561000

有數據顯示，我國普通人群乙肝表面抗原（HBsAg）陽性率為9.09%[1]，可見我國乙型肝炎患者數量眾多，若疾病控制不當，可能逐步進展為肝硬化、肝癌、肝衰竭等疾病，嚴重威脅著患者的生命安全[2-5]。目前臨床上常用核苷類藥物和干擾素治療乙肝，但此類藥物均存在效果不佳或價格昂貴等不足[6-10]。因此，新藥的研發或新的治療方法對臨床治療乙肝具有重要意義。替芬泰是從苗藥馬蹄金中分離制得的二肽衍生物[11]，具有與其他核苷類藥物不同的抗病毒機制，主要是通過誘導機體的免疫反應發揮抗病毒的作用[12]。研究顯示，替芬泰具有較好的抗乙肝病毒（HBV）的作用，同時細胞毒副作用輕，不易出現耐藥性，且使用后不易出現停藥反跳現象等優勢，有廣泛的應用前景[13-14]。動物實驗顯示，個體間對替芬泰的生物利用度存在較大的差異，可能與外排轉運體P-糖蛋白、人結腸腺癌細胞的功能和形態等因素有關，但健康人體的不良反應及藥代動力學報道較少。本研究旨在分析替芬泰片在健康人體的耐受性及其藥代動力學，為其臨床應用提供數據支持及理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

替芬泰片（批號：20140106）是由貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室合成的純度為99%的藥物。采用Waters 2695型高效液相色譜儀（美國沃特世公司），Waters 996型二極管陣列檢測器（美國沃特世公司）。

1.2 志愿者一般資料

本研究采用隨機、雙盲的方法于2017年1?6月納入26例健康志愿者作為研究對象，其中男13例，女13例；年齡22?60歲，平均（36.52±6.68）歲。26例健康志愿者，其中2例為預實驗，24例為正式實驗。納入標準：①年齡20?60歲者；②生理各項指標正常者。排除標準：①妊娠期或哺乳期女性；②對替芬泰片中的藥物相關成分過敏者；③過敏體質者。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準，健康志愿者在完全閱讀并清楚研究內容及相關事項的基礎上，簽署知情同意書。

1.3 志愿者給藥方法及血樣采集

預實驗人群采用替芬泰的劑量為300 mg 單、多次給藥，多次給藥為給藥1次/d，連續給藥7 d，正式實驗為300 mg和600 mg 分別單、多次給藥，多次給藥同預實驗，其中藥物洗脫周期為2周。

單次給藥期間，于第1 天服藥前和服藥后15、30、45 min，1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、24、36、48 h 采集血漿樣品，于前臂靜脈分別采集靜脈血4 ml；多次給藥期間，于第7、8、9 天服藥前和第9 天服藥后15、30、45 min，1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、24、36、48 h采集血漿樣品，于前臂靜脈分別采靜脈血4 ml。血樣采集后移入EDTA 抗凝管中，4℃離心5 min（3500 r/min），分離血漿，于-70℃以下冷凍保存待測。

1.4 色譜條件及血清中替芬泰及其代謝產物的檢測

色譜條件：參照2010版《中國藥典》[15]有關物質的測定方法，采用高效液相色譜-紫外檢測器進行測定。色譜柱：RP-18（ID=250 mm×4.6 mm），測定法：流動相為甲醇-0.1%三乙胺水溶液（用稀磷酸調pH值為8.0）=65∶35。流速：1.0 ml/min；熒光檢測波長為340 nm；柱溫：30℃；進樣量20 μl。Varian 9010型三元泵（美國瓦里安公司），VarianⅡ型熒光檢測器（美國瓦里安公司），數據處理軟件為Varian 系統。

抽取受試者4 ml 外周血，離心處理，采用高效液相色譜儀進行血藥濃度的相關檢測，檢測內容包括替芬泰及替芬泰代謝產物N-苯甲酰基-O-（二甲氨基乙基）-L-酪氨酸（簡稱M8）和代謝物N-苯甲酰基-L-酪氨酸-O-（N-氧化-二甲氨基乙基）-L-酪氨酸（簡稱M9）。系統適應性試驗：取供試品溶液進樣，理論板數按替芬泰峰計算≥5000，替芬泰峰和各M8、M9 峰的分離度≥1.5，主峰的拖尾因子≤2.0。溶液的配制：精密稱取供試品12.5 mg 到25 ml 量瓶中，用流動相超聲溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1 ml，用流動相溶解并稀釋至100 ml，作為對照溶液。精密量取對照溶液20 μl，注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10%?20%。再量取供試品溶液20 μl 注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3 倍，以主成分自身對照法計算M8、M9 含量。

1.5 觀察指標

采用高效液相色譜法檢測不同時間點的藥代動力學參數，分析藥代動力學參數、高效液相色譜特征及相關不良反應。①藥代動力學參數包括最高血藥濃度（Cmax）、最低血藥濃度（Cmin）、平均血藥濃度（Cavg）、一段時間內的血藥濃度曲線面積（AUC0-t）、無窮遠的血藥濃度曲線面積（AUC0-∞）及積累指數（accumulation index）等。②不良反應嚴格按照世界衛生組織（WHO）中的藥物不良反應指標及相應的分級標準，觀察替芬泰對機體各個系統的影響。詳細記錄志愿者用藥期間的消化道反應、脈搏、體溫、呼吸、血壓等，同時對志愿者使用藥物前、中、后的電解質、肝腎功能、血常規、免疫功能、尿常規、心電圖等進行檢查。

1.6 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 19.0分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 健康志愿者口服替芬泰的藥代動力學情況

健康志愿者多次口服不同劑量的替芬泰片后，替芬泰的達峰時間（Tmax）為（1.02±0.13）h，半衰期（t1/2）為（3.08±0.09）h；M8的Tmax為（3.05±0.07）h，t1/2約為（9.56±0.67）h；M9的Tmax為（4.11±0.15）h，t1/2為（6.17±0.21）h。

2.2 健康志愿者不同劑量替芬泰單次給藥和多次給藥的藥代動力學比較

300 mg 給藥劑量下，替芬泰多次給藥與單次給藥的Cmax、Cmin、Cavg、AUC0-t、AUC0-∞、積累指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05），M8和M9 多次給藥的AUC0-t和AUC0-∞高于單次給藥，差異有統計學意義（P＜0.05）；M9 多次給藥的Cmax高于單次給藥，差異有統計學意義（P＜0.05）；M8 多次給藥與單次給藥的Cmax、Cmin、Cavg及積累指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；M9 多次給藥與單次給藥的Cmin、Cavg及積累指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。600 mg 給藥劑量下，替芬泰多次給藥的Cmax高于單次給藥，差異有統計學意義（P＜0.05）；替芬泰多次給藥與單次給藥的Cmin、Cavg、AUC0-t、AUC0-∞、積累指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；M8和M9 多次給藥的Cmax和AUC0-t高于單次給藥，差異有統計學意義（P＜0.05）；M9 多次給藥的AUC0-∞高于單次給藥，差異有統計學意義（P＜0.05）；M8 多次給藥與單次給藥的Cmin、Cavg、AUC0-∞及積累指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；M9 多次給藥與單次給藥的Cmin、Cavg及積累指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.3 600 mg 給藥劑量下替芬泰片、M8、M9的高效液相色譜圖

600 mg 給藥劑量下，多次給藥使替芬泰Cmax升高，對其暴露量AUC0-∞沒有顯著影響（圖1A）；代謝物M8和M9的Cmax升高，同時暴露量AUC0-∞增加（圖1B、C）。

2.4 健康志愿者不同劑量替芬泰的不良反應情況

健康志愿者多次口服（劑量300、600 mg）替芬泰片后，600 mg 組1例志愿者發生了1次輕度咽喉部不適，有異物感的不良事件，判定為與藥物無關，無志愿者因不良事件退出試驗。

3 討論

本研究結果顯示，300 mg 給藥劑量下，替芬泰多次給藥與單次給藥的Cmax、Cmin、Cavg、AUC0-t、AUC0-∞、積累指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05），M8和M9多次給藥的AUC0-t和AUC0-∞高于單次給藥，差異有統計學意義（P＜0.05）；M9 多次給藥的Cmax高于單次給藥，差異有統計學意義（P＜0.05）；M8 多次給藥與單次給藥的Cmax、Cmin、Cavg及積累指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；M9 多次給藥與單次給藥的Cmin、Cavg及積累指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。提示300 mg 給藥劑量下，多次給藥對替芬泰的生物利用度和體內處置結果沒有顯著性影響，但會使代謝物M8和代謝物M9的體內暴露量增加。

表1 健康志愿者不同劑量替芬泰單次給藥和多次給藥的藥代動力學比較（±s）

表1 健康志愿者不同劑量替芬泰單次給藥和多次給藥的藥代動力學比較（±s）

不同劑量 Cmax（ng/ml）Cmin（ng/ml）Cavg（ng/ml）AUC0-t（hong/ml）AUC0-∞（hong/ml）積累指數替芬泰300 mg（n=24）單次給藥多次給藥t值P值替芬泰600 mg（n=24）單次給藥多次給藥t值P值M8 300 mg（n=24）單次給藥多次給藥t值P值M8 600 mg（n=24）單次給藥多次給藥t值P值M9 300 mg（n=24）單次給藥多次給藥t值P值M9 600 mg（n=24）單次給藥多次給藥t值P值521.21±162.72 607.13±120.18 2.523 0.332 5.03±1.53 5.12±1.49 1.528 0.581 60.06±8.42 60.11±8.31 1.957 0.504 1314.61±209.52 1436.32±211.23 2.315 0.385 1334.78±205.35 1458.78±227.83 2.204 0.397 0.98±0.21 1.08±0.25 1.912 0.521 1369.13±431.25 1769.41±636.33 4.135 0.036 5.71±2.27 5.89±2.41 2.561 0.269 151.32±51.22 159.10±50.64 1.422 0.655 3765.27±1206.33 3793.41±1218.50 1.016 0.851 3812.71±1215.24 3831.89±1207.49 1.025 0.812 0.96±0.09 1.01±0.02 2.694 0.126 1687.16±364.46 1866.28±259.55 1.877 0.524 33.07±10.25 33.85±11.44 2.663 0.158 504.16±81.25 510.41±89.70 2.715 0.089 11 514.99±2156.86 12 762.02±2335.99 5.153 0.022 11 610.96±2152.33 12 961.68±2383.29 5.249 0.021 1.18±0.13 1.27±0.20 2.155 0.412 3291.45±776.72 3763.51±939.73 4.357 0.031 81.24±20.38 85.56±23.63 2.917 0.073 1006.31±198.29 1018.96±205.47 2.592 0.245 23 158.84±4050.39 25 475.03±5021.00 5.631 0.019 23 348.32±4055.41 25 766.88±5189.90 2.416 0.348 1.11±0.21 1.19±0.23 1.633 0.549 186.91±47.64 230.65±60.48 3.856 0.041 4.68±1.43 4.91±1.59 1.314 0.717 71.24±15.98 76.66±17.20 1.369 0.696 1639.48±345.26 1908.26±417.01 4.372 0.029 1650.82±346.27 1929.91±414.66 4.679 0.025 1.09±0.23 1.14±0.22 1.489 0.617 485.53±215.66 595.31±290.18 3.719 0.045 13.61±3.66 13.97±3.89 1.945 0.516 187.39±75.66 191.38±78.08 2.014 0.487 3919.60±1282.19 4745.58±1894.35 3.814 0.043 3938.27±1282.76 4764.74±1897.03 3.926 0.039 1.01±0.04 1.09±0.09 3.126 0.067

本研究結果顯示，600 mg 給藥劑量下，替芬泰多次給藥的Cmax高于單次給藥，差異有統計學意義（P＜0.05）；替芬泰多次給藥與單次給藥的Cmin、Cavg、AUC0?t、AUC0-∞、積累指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；M8和M9 多次給藥的Cmax和AUC0-t高于單次給藥，差異有統計學意義（P＜0.05）；M9 多次給藥的AUC0-∞高于單次給藥，差異有統計學意義（P＜0.05）；M8 多次給藥與單次給藥的Cmin、Cavg、AUC0-∞及積累指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；M9 多次給藥與單次給藥的Cmin、Cavg及積累指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究結果還顯示，600 mg 給藥劑量下，多次給藥會使替芬泰Cmax升高，對其暴露量AUC0-∞沒有顯著影響；會使代謝物M8和M9的血藥峰濃度升高，同時暴露量增加。提示若此濃度的藥物用于患者，在患者安全耐受的情況下，AUC的提高則可使患者的治療效果更好[16]。

替芬泰300、600 mg 多次給藥后，血漿中替芬泰、代謝物M8和代謝物M9的蓄積系數在兩劑量組間數值相當。根據蓄積系數的計算結果，在300、600 mg 劑量下多次給藥后，替芬泰未表現出蓄積，其代謝物M8和代謝物M9 亦未表現出明顯蓄積。本研究結果顯示，健康志愿者多次口服（劑量300、600 mg）替芬泰片后，600 mg 組1例志愿者發生了1次輕度咽喉部不適，有異物感的不良事件，判定為與藥物無關，無志愿者因不良事件退出試驗。提示多次口服（劑量300、600 mg）替芬泰片在健康人群中安全性較好。

綜上所述，替芬泰片600 mg 仍未表現出明顯的蓄積作用，且安全性高，為了取得較好的抗病毒效果，可建議每日參考劑量為600 mg。

圖1 600 mg 給藥劑量下替芬泰片、M8、M9的高效液相色譜圖