心房顫動患者hsa-miR-4443的變化及其影響與機制

肖婧雯 張 彥▲ 戴亨紛 唐 媛 歐陽煜 李川川 余美琴 林小花

1.福州市第一醫院心血管內科，福建福州 350004；2.福州市第一醫院心血管內科心臟超聲室，福建福州 350004；3.福州市第一醫院藥劑科，福建福州 350004

既往研究表明[1-5]，部分miRNA通過調節心臟成纖維細胞（HCFB）活性影響心臟纖維化。HCFB在心臟中維持著心肌細胞外基質（ECM）的穩態，為心肌細胞提供結構和機械支持[2]。心房纖維化是心房顫動的重要臨床標志，是心律失常發展的重要步驟[3-4]。心房纖維化破壞心房結構的同質性，導致心臟電生理異常，誘發心房顫動[5]。阻止心房纖維化可能是預防心房顫動的有效方法[6]。通過檢索DAVID（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）數據庫[7]，發現hsa-miR-4443與心房顫動的關系尚未見報道，因此，本研究收集了2017年1月～2018年1月間共100例患者，旨在探討hsa-miR-4443在心房顫動患者中的變化及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月～2018年1月在本院就診的持續性心房顫動（持續心房顫動至少1年）患者50例作為房顫組，其中男36例，女14例，平均（66.8±1.2）歲，左心房內徑（LAD）43.55（40.09～47.69）mm，左室射血分數（LVEF）55.00（47.30～60.38）%。并隨機選取了50例同期未發現心房顫動的志愿者作為對照組，其中男34例，女16例，年齡（64.7±1.5）歲，LAD為38.72（35.65～41.50）mm，LVEF為58.85（54.53～63.50）%。所有患者均接受了體格檢查、以及心電圖、超聲檢查和常規生化檢查包括低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、C反應蛋白（CRP）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG），見表1。臨床試驗分成房顫組和對照組，房顫組體格檢查可見心尖部聞及第一心音強弱不等、心律絕對不齊、心率大于脈率；心電圖檢查顯示P波消失，出現大小和形態不一且不整齊的f波；應用Vivid Q彩色多普勒超聲診斷儀檢查心臟并測量LAD和LVEF。本研究通過福州市第一醫院醫學倫理委員會批準，并獲得所有患者知情同意。排除標準：（1）患有結構性心臟病；（2）嚴重的動脈粥樣硬化疾病；（3）易發心房顫動的相關疾病（如甲狀腺功能亢進）；（4）腎功能不全，如患有嚴重2型糖尿病、感染或纖維化疾病；（5）正接受抗心律失常藥物治療，服用降脂藥物和甾體或非甾體藥物。

1.2 方法

1.2.1 試劑 NucleoZOL、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司；ELISA試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司；人心臟成纖維細胞（HCFB）購自美國Lonza公司；胎牛血清、DMEM-F12培養基、胰酶蛋白酶購自美國Gibco公司；Lipofectamine?2000轉染試劑購自美國Invitrigen公司；miR-4443 mimic、inhibitor及其陰性對照mimic NC、inhibitor NC購自上海GenePharma公司；AnnexinV Alexa Fluor 488/PI試劑盒、BCA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；細胞培養瓶、Transwell小室購自美國Corning公司；CCK-8試劑盒、4%多聚甲醛、結晶紫染色液、PMSF蛋白裂解液、10%SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、NC膜、牛血清蛋白（BSA）購自上海碧云天生物科技有限公司；THBS1抗體、TGF-β抗體、Smad2/3抗體、LTBP1抗體、collagen I抗體、collagen Ⅲ抗 體、α-SMA抗 體、β-actin抗 體、GAPDH抗體購自英國abcam公司；ECL發光試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2.2 血清hsa-miR-4443水平測定 采集房顫組和對照組患者的靜脈血10mL，室溫靜置1h，3000rpm離心5min，分離血清并保存于-80℃冰箱備用。采用實時熒光定量逆轉錄PCR（Realtime RT-PCR）測定患者血清hsa-miR-4443表達水平。采用NucleoZOL法[7]提取血清總RNA，通過GoScript?反轉錄試劑將RNA逆轉錄為cDNA，加入GoTaq?qPCR 反應混合物并在qPCR儀中進行Realtime RT-PCR反應。檢測條件為95℃ 5min；95℃ 10s；60℃ 30s；72℃ 30s；95℃ 15s；60℃ 60s，經過40個循環。使用引物序列：hsa-miR-4443，forward：5’-GCGCGTTGGAGGCGTG-3’，reverse：5’-AGTGCAGG GTCCGAGGTATT-3’；內參hsa-miR-16，forward：5’-TAGCA GCACGTAAATATTGGCG-3’，reverse：5’-ATCGTCGTGCATTTATAACCGC-3’。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.2.3 血清PⅢNP、PINP和PICP水平測定 通過ELISA法測定心肌纖維化生物標志物Ⅲ型原膠原N端前肽（PⅢNP）、Ⅰ型原膠原N端前肽（PINP）和Ⅰ型前膠原羧基端肽（PICP）水平。將房顫組和對照組患者的血清樣本按照ELISA試劑盒操作，置于酶標儀450nm處，檢測吸光度值。

1.2.4 細胞培養和轉染 HCFB用含10%胎牛血清的DMEM-F12培養基，在37℃、5%CO2條件的恒溫培養箱中培養。采用0.25%胰酶蛋白酶消化細胞，調整細胞濃度1×105個/mL，接種于24孔板，待細胞融合率達到30%～50%時，采用Lipofectamine?2000轉染試劑轉染miR-4443 mimic、inhibitor及其陰性對照mimic NC、inhibitor NC，對照組不進行質粒轉染用以對照。在轉染48h后，通過熒光顯微鏡觀察熒光強度，分析轉染效率。

1.2.5 細胞增殖和凋亡檢測 實驗分為5組，分別為miR-4443 mimic、mimic NC、miR-4443 inhibitor、inhibitor NC，對照組為不加任何干預的空白對照組。采用CCK-8試劑檢測HCFB細胞增殖能力。具體操作為調整細胞濃度1×105個/mL，接種到96孔板，每孔約100μL細胞懸液。在接種后0、24、48、72和96h，五個時間點向每孔細胞中加入100μL 10% CCK-8溶液，繼續培養1～2h，最后將細胞懸液置于酶標儀450nm波長下測定吸光度值。

采用AnnexinV Alexa Fluor 488/PI試劑檢測細胞凋亡率。細胞接種到96孔板，37℃培養24h后，預冷磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌2次，加入結合緩沖液重懸細胞，調整濃度1×106個/mL。取100μL細胞置于流式管，加入5μL Annexin V/Alexa Fluor 647和10μL 20μg/mL碘化丙錠溶液，混勻后避光孵育15min，加入400μL PBS，置于流式細胞儀上分析。

1.2.6 細胞遷移和侵襲檢測 利用Transwell小室分析細胞遷移能力。調整細胞濃度1×105個/mL，取100μL細胞懸液加入Transwell上室，下室加入600μL完全培養基，37℃培養24h。移除液體，下室加入600μL 4%多聚甲醛固定30min，棄固定液并擦除未遷移細胞，加入600μL0.1%結晶紫染色液染色15min，PBS洗滌小室2次，在倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，計算細胞數。

通過Transwell實驗分析細胞侵襲能力。采用BD Matrigel? 基質膜包被 Transwell上室，經過4℃風干，37℃使其徹底凝固后，置于24孔板，其余操作同遷移實驗。

1.2.7 miR-4443靶基因驗證和THBS1mRNA檢測 采用雙熒光素酶報告基因系統鑒定miR-4443靶基因為THBS1。設計THBS13’UTR野生型（WT）引物CAGACUCAGCAUUCAGCCUCCAA和突變型（Mut）引物CAGACUCAGCAUUCAAGCCUAGA，分別插入psiCHECKTM-2雙熒光素酶報告載體，構建野生型和突變型重組雙熒光素酶報告載體，分 別 為psiCHECKTM-2-THBS13’-UTR-WT 、psiCHECKTM-2-THBS13’-UTR-Mut。將miR-4443 mimic或mimic NC和psiCHECKTM-2-THBS13’-UTR-WT或psiCHECKTM-2-THBS13’-UTRMut雙熒光素酶報告載體共轉染293T細胞。轉染48h后，通過雙熒光素酶檢測試劑檢測螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，結果以螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性比值表示。

收集細胞，采用NucleoZOL法提取總RNA，逆轉錄為cDNA，加入GoTaq?qPCR 反應混合物進行Real-time RT-PCR反應。使用引物序列THBS1，forward：5’-GGCACCAACCGCATTCCAGAG-3’，reverse：5’-GCACAGCATCCACCAG GTCTTG-3’；內參GAPDH, forward：5’-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3’，reverse：5’-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3’。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.2.8 蛋白含量檢測 收集細胞，加入PMSF蛋白 裂 解 液 裂 解 細 胞20min，4（C、12000rpm離心20min，取 上 清 液，加 入loading buffer，95℃水浴加熱5min，使蛋白質充分變性。采用BCA試劑測定蛋白濃度，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后轉印至NC膜上，用5% BSA封閉2h，一抗[THBS1（ab231115）、TGF-β（ab179695）、Smad2/3（ab202445）、LTBP1（ab89723）、collagenI（ab34710）、collagenⅢ（ab6310）、α-SMA（ab5694）、β-actin（ab6272）和GAPDH（ab181602）]，均購自abcam4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育2h，TBST洗膜3次，孵育ECL發光試劑并用化學發光儀顯影，之后采用凝膠成像系統進行成像。使用Image J圖像分析軟件對目的條帶及內參條帶進行灰度分析。

1.2.9 統計分析 所有實驗數據均采用SPSS20.0和GraphPad Prism統計軟件進行分析。數據服從正態分布，兩兩比較采用t檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。數據不服從正態分布，以中位數和四分位區間[Q1～ Q3]表示，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗分析。計量資料采用χ2檢驗。相關性分析采用使用Spearman檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者各項指標比較

兩組年齡、性別、LDL-C、HDL-C比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。房顫組CRP、TC、TG、PINP、PICP、PⅢNP、LAD明顯高于對照組（P＜0.05）而LVEF顯著降低（P=0.008），見表1。提示AF患者心功能降低、伴有纖維化改變和炎癥反應。

2.2 血清hsa-miR-4443表達水平比較

RT-qPCR結果顯示，健康對照組血清中hsamiR-4443的表達水平為0.66（0.40～0.99），AF患者血清hsa-miR-4443表達水平為0.21（0.11～0.30），Mann-Whitney U檢驗結果顯示，AF患者血清hsamiR-4443表達水平較對照組顯著降低（P＜0.001）。

2.3 miR-4443 mimic和inhibitor轉染效率分析

與mimic NC組（1.15±0.09）相 比，mimic組（9.66±0.42）miR-4443 表達顯著升高（P＜0.05）。與inhibitor NC組（0.98±0.09）相 比，inhibitor組（0.52±0.05）miR-4443 表達顯著降低（P＜0.05）。

2.4 miR-4443對細胞生物學功能的影響

與mimic NC組相比，miR-4443 mimic組細胞增殖、遷移和侵襲能力顯著降低（P＜0.05），細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）。與inhibitor NC組相比，miR-4443 inhibitor組細胞增殖、遷移和侵襲明顯提高（P＜0.05），而細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見表2。

表1 房顫組和對照組各項指標比較

表2 轉染miR-4443 mimic和 inhibitor對HCFB生物學功能的影響（±s）

表2 轉染miR-4443 mimic和 inhibitor對HCFB生物學功能的影響（±s）

組別 mimic mimic NC t P inhibitor inhibitor NC t P增殖（OD） 0.79±0.02 1.06±0.10 18.721 0.000 1.35±0.11 1.02±0.10 15.697 0.000凋亡率（%） 8.92±0.34 5.46±0.23 59.602 0.000 3.75±0.31 5.50±0.50 21.034 0.000遷移（個） 30.13±1.50 93.91±2.14 172.573 0.000 143.51±5.85 107.25±3.31 38.146 0.000侵襲（個） 62.14±2.73 111.93±5.49 95.283 0.000 135.02±8.42 98.56±4.33 27.229 0.000

2.5 miR-4443靶基因分析及雙熒光素酶活性檢測

TargetScan預測發現THBS1基因是miR-4443的潛在靶基因。設計THBS13’-UTR-WT、THBS13’-UTR-Mut序列，見圖1，構建雙熒光素酶報告載體。熒光素酶活性檢測結果顯示，共轉染THBS13’UTR-WT報告載體，miR-4443 mimic組（0.66±0.16）熒光素酶活性較miR-4443 NC組（1.00±0.12）明顯降低（P＜0.05）；而共轉染THBS13’UTR-Mut報告載體，miR-4443 mimic組（0.95±0.03）與mimic NC組（1.03±0.06）熒光素酶活性無統計學差異（P＞0.05）。

2.6 miR-4443靶向調控THBS1表達

與mimic NC組（0.92±0.05）相比，miR-4443 mimic組（0.53±0.08）THBS1 mRNA表達顯著降低（P＜0.05）。inhibitor組（1.45±0.11）與inhibitor NC組（0.88±0.03）相比，THBS1 mRNA表達顯著增加（P＜0.05）。

圖1 hsa-miR-4443與THBS13’-UTR的結合位點及突變形式

2.7 miR-4443靶向THBS1調控TGF-β1 /α-SMA/collagen信號

與mimic NC組相比，miR-4443 mimic組LTBP1表達顯著增加，而THBS1、TGF-β、Smad2/3、α-SMA、collagen I和collagen Ⅲ蛋白表達顯著減少（P＜0.05）。而miR-4443 inhibitor組，LTBP1蛋白表達較inhibitor NC組顯著降低，THBS1、TGF-β、Smad2/3、α-SMA、collagen I和collagen Ⅲ蛋白表達顯著提高（P＜0.05）。

3 討論

最近研究發現，hsa-miR-4443通過調節細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲來影響癌癥發生和進展[9-10]。然而，關于hsa-miR-4443在心房顫動中的研究尚少。本研究結果顯示，THBS1是hsa-miR-4443的靶點。THBS1是一種介導細胞間相互作用的細胞外基質糖蛋白[11]，其通過激活TGF-β促進細胞生長，從而調控纖維化進程[12-13]。LTBPs作為細胞外基質糖蛋白，能與TGF-β特異性結合[14]，在TGF-β的分泌和激活過程中發揮了重大作用[15]。過表達hsa-miR-4443將提高LTBP1水平而抑制TGF-β信號通路。在皮膚纖維化和肺纖維化的過程中，TGF-β能有效激活TGF-β1/p-Smad2/3信號并刺激THBS1表達[16]。同樣在心房纖維化的過程中，TGF-β/Smad通路激活后誘導HCFBs中α-SMA及膠原蛋白的表達[17]。α-SMA是平滑肌特異性標志物，其預示著HCFBs已轉化為肌成纖維細胞。肌成纖維細胞合成了過量的I型膠原和Ⅲ型膠原，進一步導致纖維化。且已有研究證實，PICP和PⅢNP作為Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成的血清標志物，二者的水平升高與左房纖維化和心房顫動的發生呈正相關[18]。可能是因為I型和Ⅲ型膠原在細胞外間質中蓄積將延長肌細胞之間的傳導時間，導致心律失常。同時，LAD是心房顫動消融后復發的獨立預測因子[19]；LAD體積增大，將導致左心室收縮功能下降，心房興奮時間延長，從而誘發心房顫動[20]。不同程度的纖維化影響著AF的發生和維持[21]。以上研究結論與本研究結果呈現一致性：PICP、PⅢNP、LAD與血清hsa-miR-4443水平呈負相關。

圖2 轉染 miR-4443 mimic和 inhibitor對TGFβ1 /α-SMA /collagen信號的影響

因此，hsa-miR-4443參與調節心房纖維化來影響心房顫動，是心房顫動的危險因素之一，增加hsa-miR-4443表達可能是治療心房顫動的有效策略。