不同年齡不孕患者卵泡液游離DNA和血管內皮生長因子含量對胚胎發育潛力的影響分析

何正枝 林 冰 甄錦壯 嚴紅蓮

廣東醫科大學順德婦女兒童醫院 （佛山市順德區婦幼保健院）生殖科，廣東佛山528300

體外受精-胚胎移植（IVF-ET）中選擇整倍性胚胎移植后即使植入成功也并非都能獲得持續妊娠，表明胚胎發育潛力也不能僅通過染色體的狀態來評估[1]，應繼續探討新的預測評估胚胎發育潛力指標，提早進行干預治療將能改善胚胎結局。本研究通過檢測2018年12月～2020年4月共94例周期患者卵泡液游離DNA（cfDNA）、血管內皮生長因子（VEGF）含量與胚胎發育質量的關系，探討其在預測胚胎發育潛力的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年12月～2020年4月在本院接受輔助生殖技術助孕的94例周期患者，納入標準：（1）輔助生殖技術助孕適應證為輸卵梗阻/缺如；（2）在研究期間行常規IVF-ET患者的第一個周期。排除標準：（1）男方取卵日因精液質量下降嚴重、睪丸取精、受精低下等行卵泡漿內單精子注射技術；（2）取卵日未獲得卵母細胞；（3）女方有可能影響卵子質量的基礎疾病。共納入94例周期患者，年齡23～44歲，按照年齡分組,年齡≥35歲的患者為研究組（n=44），年齡＜35歲的患者為對照組（n=50）。女性患者卵巢儲備功能基本處于正常范圍，男方精液基本正常。本研究通過本院醫學倫理委員會批準，且與患者簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 卵泡液收集 取卵日手術醫生對直徑＞17mm的卵泡優先進行穿刺，將取得的第一管顏色清亮的卵泡液傳遞到胚胎實驗室。撿取卵丘冠復合物后將卵泡液以3000r/min、10min離心，留取上清液，-80℃保存待檢。

1.2.2 卵泡液cfDNA檢測 購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司的EXKubit dsDNA HS分析試劑盒，使用Qubit3.0熒光檢測儀按照操作說明書進行檢測，記錄數據。

1.2.3 卵泡液VEGF檢測 購自武漢博士德Human VEGF PicoKine ELISA Kit試劑盒，HR801酶標儀讀取吸光度，根據標準品得出的曲線進行數值計算。

1.2.4 胚胎質量參數收集

1.2.4.1 受精卵觀察 參照 Nasiri[2]的分級法：根據卵胞質內原核數量、合子中核的位置、大小、排列及核內核仁的數目、大小、分布情況對受精卵進行評估，依評估結果將正常受精卵分為 Z1、Z2、Z3、Z4 四個等級。

1.2.4.2 卵裂期胚胎評分 參照日內瓦胚胎評分標準：根據卵裂球的數目、均勻程度、形成碎片的多少評分。

1.2.4.3 囊胚評分 參照Gardner囊胚分級法：首先根據囊腔的擴張程度將其分為6期，1期：囊胚腔＜囊胚體積的1/2；2期：囊胚腔＞囊胚體積的1/2；3期：囊胚腔充滿整個囊胚； 4期：透明帶變薄，囊胚腔擴張；5期：正在孵出的囊胚；6 期：完全孵出的囊胚。內細胞團分為3個級別，A級：細胞數多，細胞結合緊密；B級：細胞數較少，細胞結合較松散；C 級：細胞數極少。滋養層細胞也分為3個級別，A 級：細胞數目多，囊胚四周均有細胞分布；B 級：細胞數目較少，上皮細胞較松散；C 級：細胞數目極少。

正常受精率=2PN/獲卵數×100%、可利用胚胎率=可利用胚胎數/卵裂數×100%、卵裂期優質胚胎率=卵裂期優質胚胎數/卵裂數×100%、繼續培養囊胚形成率=形成囊胚數/繼培胚胎數×100%、優質囊胚率=優質囊胚數/繼培胚胎數×100%。

可利用胚胎定義：培養到第三天時用于移植、冷凍及胚胎繼續培養發育達到優質囊胚標準的數目總和；卵裂期優質胚胎定義為：第一天原核評分為2PN、Z1或2PN、Z2；第二天卵裂球數為4～5個，卵裂球均一（E）或部分不均（U），碎片0%～15%；第三天卵裂球數為7～9個，卵裂球均一（E）或部分不均（U），碎片0%～15%；優質囊胚率定義：根據囊胚腔的擴張程度、內細胞團大小及外滋養層細胞數量，評分達到3BC/3CB及以上的囊胚。

1.3 胚胎的觀察時間

1.3.1 卵母細胞采集 采用常規促排卵方案，卵泡生長成熟充分時，于注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）后36～38h在陰道B超介導下穿刺取卵，在體式顯微鏡下從卵泡液中撿取卵丘冠復合物后轉移到二氧化碳培養箱中培養2～4h。

1.3.2 體外授精 把優化處理后的精液按照一定的比例加入到培養皿中進行授精操作，于授精后4h拆除卵母細胞周圍的顆粒細胞觀察第二機體出現率，如果大于30%則為受精成功。

1.3.3 胚胎及囊胚的觀察 受精后的第一天記錄受精卵的原核情況，第2、3天記錄分裂期胚胎情況，培養到第3天將需要行囊胚培養的卵裂期胚胎轉移到專用的囊胚培養液中繼續培養2～4d，記錄囊胚形成情況。

1.4 統計學分析

應用SPSS19.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（） 表示，采用t檢驗，計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組間體重指數（BMI）、促性腺激素（Gn）使用時間比較，差異無統計學意義（P＞0.05），不孕年限比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 兩組卵泡液cfDNA、VEGF含量比較

研究組患者cfDNA含量明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），研究組患者VEGF含量比對照組有所升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表1 兩組患者一般資料比較（±s）

表1 兩組患者一般資料比較（±s）

組別 BMI（kg/m2）Gn使用時間（d）不孕年限（年）研究組（n=44） 22.39±3.47 11.68±2.44 4.48±3.94對照組（n=50） 21.34±3.01 12.34±3.35 3.14±2.22 t 1.571 1.079 2.062 P 0.104 0.332 0.032

表2 兩組患者卵泡液cfDNA、VEGF含量比較（±s，pg/mL）

表2 兩組患者卵泡液cfDNA、VEGF含量比較（±s，pg/mL）

組別 cfDNA VEGF研究組（n=44） 27.96±4.43 761.45±436.79對照組（n=50） 22.14±3.35 671.33±417.22 t 7.225 1.022 P 0.001 0.309

2.3 兩組患者胚胎發育參數比較

研究組的繼續培養囊胚形成率及優質囊胚率明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），兩組正常受精率、可利用胚胎率、卵裂期優質胚胎率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 兩組患者胚胎發育參數比較 [%（n/n）]

3 討論

外周血cfDNA主要來源于細胞的凋亡及壞死，以雙鏈DNA、DNA蛋白質復合物等形式存在于血液中，大小為150～210000bp不等的片段。1948年Mandel[3]首次在健康人外周血中發現了游離DNA的存在，由于健康人群自身機體平衡機制的作用使其含量維持在較低水平。1997年Lo等[4]首次證實孕婦血漿（清）中存在游離胎兒DNA并將其應用于性連鎖遺傳病中，為產前診斷開辟了無創產前診斷新途徑，隨后在人體其他體液如精液、尿液、腦脊液、卵泡液及囊胚液中均檢測到cfDNA的存在[5]。Thierry等[6]研究發現血漿cfDNA與腫瘤組織DNA的測序達96%以上一致，由于腫瘤的異質性使其在腫瘤細胞穿刺過程或組織活檢中可能只檢測到部分的亞型，而血漿cfDNA則能全面地檢測分析出腫瘤的分子亞型。在IVF-ET中卵子質量包括卵子完成正常減數分裂、受精、胚胎生成以及后續發育的能力，是胚胎發育潛能的決定因素，也是影響助孕結局的主導因素[7]。卵母細胞在發育成熟的過程中所需的營養物質均來自于卵泡液，所產生的代謝產物也排泄入卵泡液中[8]。國內外有報道關于輔助生殖患者血清及卵泡液中各成分的變化對臨床結局的影響，但缺乏對卵泡液中cfDNA和VEGF含量檢測對不同年齡不孕患者胚胎發育潛力預測分析的報道。本研究中卵泡液cfDNA含量在卵裂期胚胎發育中未產生明顯影響，但在發育到囊胚階段就產生較大的影響，并隨著年齡的增長，卵泡液cfDNA含量增加而囊胚形成的數量及質量明顯下降，兩組間差異有統計學意義（P＜0.05）。卵泡液中cfDNA可能是卵母細胞在發育成熟過程中遇到應激反應或自身新陳代謝異常的產物釋放到卵泡液中，能反映卵子質量高低的指標之一，在胚胎培養體系中獲得高質量的卵子是培養出優質胚胎的前提條件，給患者帶來更實際性的幫助。卵母細胞是在充滿卵泡液的微環境中發育和成熟，研究卵泡液微環境中各種物質及細胞因子的改變對卵子質量的影響及卵泡發育的調節機制，為了使胚胎體外培養體系更加接近機體的生理環境，獲得理想的妊娠結局。取卵過程中B超顯示卵泡的直徑不一定與卵子的成熟度相關，憑主觀上的卵泡直徑大小并不能明確說明卵子的成熟度及質量高低，如何能快速準確反映卵母細胞成熟度及卵子質量，對預測胚胎發育潛力顯得尤為重要，也將成為輔助生殖技術探索的新方向。王興玲等[9]研究表明cfDNA在預測卵母細胞成熟度和胚胎質量方面的應用有很大價值，研究結果顯示游離DNA含量與卵母細胞質量及胚胎質量有相關性，使用脫氧核糖核酸酶來降低cfDNA含量的靶向治療將會成為治療不孕患者的高效技術之一。

VEGF是肝素結合雙鏈糖蛋白，在血管生成、血管通透性、細胞增殖等方面起著重要作用。曹娟等[10]研究表明，VEGF刺激血管內皮細胞數目增多而加速血管的形成，誘導內皮細胞產生蛋白水解酶、組織因子及間質膠原酶等改變血管通透性，加快纖維蛋白原及血漿蛋白的外滲導致間質水腫、損傷細胞外基質，在腫瘤細胞的生長浸潤以及轉移過程中發揮重要作用。也有研究[11]表明，VEGF參與糖尿病血管并發癥的發生發展全過程。卵泡液中VEGF能夠促進卵泡周圍微血管形成，使卵泡從血液中獲得營養物質，為卵泡的發育、卵母細胞的成熟、胚胎的著床提供良好的局部環境[12]。Konc等[13]研究表明，在卵泡生長發育過程中，顆粒細胞上和卵泡膜細胞上的VEGF表達強度隨著卵泡生長發育而增強，排卵前VEGF升高可能反映了顆粒細胞和卵泡膜細胞的增殖和成熟，提示卵泡成熟。目前評價胚胎質量的優劣程度主要參照胚胎發育形態學規律，建議在觀察胚胎形態學變化的基礎上測定卵泡液中VEGF含量，采取有效的措施降低劣胚形成率。有研究進一步表明在卵泡液中加入適量的VEGF而人為改變卵子成長發育微環境，有助于提高胚胎質量并提高助孕成功率[14]。本研究中卵泡液VEGF含量在兩組間差異無統計學意義（P＞0.05），可能與所納入例數有關但研究組卵泡液VEGF含量稍高于對照組，研究組的卵裂期胚胎質量和對照組相當，但研究組的囊胚形成率和優質囊胚率比對照組差，說明卵泡液VEGF促進卵泡周圍微血管生成，血管通透性增加從而使卵泡液中含有更多的卵泡刺激素、黃體生成素和其他營養物質作用于卵巢顆粒細胞及卵泡膜細胞，從而誘導卵母細胞成熟過度。有研究發現[15]卵泡液中低VEGF水平的優質胚胎具有高種植能力而高VEGF含量則預示胚胎發育不良。本研究中卵泡液VEGF含量與胚胎發育潛力是否有相關性還需進一步研究。

胚胎發育是一個動態變化的過程，僅從卵裂期胚胎的傳統形態學評分來判斷其發育潛力還不完全準確，囊胚培養是衡量體外胚胎發育潛力的有效方法[16]。根據本研究結果推測，卵泡液cfDNA含量對胚胎發育過程中囊胚的形成及質量有著一定的影響，對不同年齡不孕患者胚胎發育潛力有預測價值；卵泡液VEGF含量隨著年齡的增長有所升高，但在兩組不同年齡患者中的差異無統計學意義，對胚胎發育質量沒有明顯的影響。目前對cfDNA、VEGF的檢測可能受到標本來源和處理辦法、實驗操作及靈敏度等問題，還需要建立標準化的臨床檢測流程。研究組的促性腺激素總量比對照組大，可能與患者年齡增大對藥物的反應性降低有關。為了能更深入探討卵泡液中cfDNA、VEGF含量對胚胎發育潛力評估，還需要大樣本的研究來論證。