兩種非手術方法建立犬骨關節炎動物模型的對比研究

王朝強 李雪麗 何曉宇 李惠梅 吳李勇 周之平 王 春

福建醫科大學附屬閩東醫院，福建福安 355000

膝關節骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是常見的退行性疾病之一。隨著社會人口老齡化，發病率逐年增高，嚴重危害人類的健康，同時也對社會經濟造成極大的負擔[1]。有研究顯示，中國有癥狀的KOA的患病率為8.1%[2]。骨關節炎是以關節軟骨退行性改變為核心，累及軟骨下骨，包括滑膜、關節及其他結構改變的慢性炎癥[3-4]。骨關節炎動物模型是研究骨關節炎發病機制、危險因素及其治療方法的重要手段[5]。目前還缺乏既符合人類關節炎的病理發展特點，又可以為臨床診斷治療提供有力證據的動物模型[5-7]。本研究采用關節腔內Ⅱ型膠原酶注射法及關節制動法建立犬KOA動物模型，可作為研究膝關節骨關節炎的理想動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Beagle犬12只（普通級），均2歲左右，9雌3雄，購于福州振和實驗動物技術開發有限公司[許可證編號：SCXK（閩）2012-0001]，比格犬膝關節均無明顯異常，精神狀態良好。本研究符合福建醫科大學附屬閩東醫院對研究的相關倫理要求[批件號：[2019]寧閩醫倫理審字第（0916-0）號]。

1.1.2 實驗設備及試劑 GE3.0T 750MR機、柯達750DR機、孝感亞光包埋機、顯微照相機等。高分子石膏，Ⅱ型膠原酶（美侖生物），Ⅳ型膠原蛋白免疫組化試劑盒（武漢博士德）等。

1.2 實驗動物分組

比格犬12只，隨機分為藥物組（Ⅱ型膠原酶關節腔內注射法）和石膏組（關節制動法），藥物組犬于關節腔內分別注射4mg/mL的Ⅱ型膠原酶0.1mL，石膏組的實驗犬于關節過伸位固定[6-10]。

1.3 檢測方法及病理學檢測

在實驗前及實驗后1、3、6、12周分別行關節正側位X線片、MRI檢查。影像學檢查方法：實驗犬麻醉后仰臥于檢查床，沙袋固定、伸直雙側下肢，行正側位照片，同法進行膝關節MRI掃描。并于實驗后3、12周將實驗犬分批手術，切取關節內軟骨及軟骨下骨組織，行病理學檢查。病理學檢查方法：實驗犬麻醉后切開膝關節腔，手術切取部分滑膜組織，再分別于負重部位切取軟骨面至軟骨下骨柱狀標本，制備成5μm厚的石蠟切片，分別行HE染色、阿利新藍染色、Masson染色及Ⅳ型膠原蛋白免疫組化檢測，光學顯微鏡下觀察。

1.4 觀察指標

觀察的指標包括膝關節X線片、MRI檢查結果、組織病理學檢查等，并以改良Mankin評分標準對關節軟骨的病理改變作量化分析[11-12]。

1.5 統計學方法

應用SPSS15.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（）表示，采用配對樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 犬膝關節X線

在造模前后比較中，石膏組造模后X線片見關節間隙稍變窄、模糊，髁間嵴稍變尖，見唇狀骨質增生，髕骨間隙略變窄，藥物組造模后X線片檢查主要表現為關節間隙變窄。見圖1、2。

圖1 石膏組X線圖像（1a 固定前、1b 固定后3周、1c 固定后12周）

圖2 藥物組X線影像（2a 藥物注射前、2b 藥物注射后3周、2c 注射后12周）

2.2 犬膝關節MRI檢查

在實驗終點犬膝關節MRI檢查中，石膏組顯示膝關節積液，量較大，關節軟骨表面不規則，缺失的最大深度超過50%，部分出現軟骨剝脫，病理分級達到Ⅲ級以上。藥物組提示關節積液，相對于石膏組積液量較少，關節軟骨表面不規則，缺失的最大深度在50%左右，病理分級也達到Ⅱ級以上。見圖3 ～ 5。

2.3 犬膝關節病理學檢查

兩組病理學檢查均出現膝關節炎特征性的病理學改變。早期見關節軟骨基質變薄，細胞老化、凋亡，藥物組早期病理改變較為明顯，后出現軟骨細胞排列紊亂，潮線上移，然后軟骨表面裂隙、剝脫，細胞成簇生長、甚至出現細胞減少，潮線模糊消失。兩組HE染色均可見染色變深，膠原纖維、細胞老化。Masson染色中見膠原纖維染色變深老化，炎癥浸潤。阿利新藍染色中可見到關節軟骨基質中染色明顯變淺，表面其粘多糖含量減少，在石膏組后期尤為明顯。在Ⅳ型膠原蛋白免疫組化中見斑片狀或團塊狀染色，提示軟骨內血管生長并穿入軟骨層。最終石膏組病理分級根據改良Makin評分以中重度為主，藥物組以輕中度為主。見圖6～9。

圖3 術前MRI圖像

圖4 石膏組12周MRI影像

圖5 藥物組12周MRI影像

2.3.1 Masson染色

圖6 正常、藥物組及石膏組犬膝關節組織Masson染色結果（×40、×100、×200、×400）

2.3.2 HE染色

圖7 正常、藥物組及石膏組犬膝關節組織HE染色結果（×40、×100、×200、×400）

2.3.3 阿利新藍染色

圖8 正常、藥物組及石膏組犬膝關節組織阿利新藍染色結果（×40、×100、×200、×400）

2.3.4 Ⅳ型膠原蛋白免疫組化

圖9 正常、藥物組及石膏組犬膝關節組織Ⅳ型膠原蛋白免疫組化結果（×40、×100、×200、×400）

表1 兩組犬骨關節炎動物模型的改良Makin評分

2.4 兩組犬骨關節炎動物模型的改良Makin評分

隨著時間的延長，石膏組的病理改變在實驗3周較輕，后逐漸加重，至12周時發展為中重度膝關節炎。藥物組膝關節炎病理改變主要發生在3周，隨著時間的延長，關節炎并未顯著加重。見表1。

3 討論

KOA發病率高，對生活影響較大。膝關節炎的動物模型制備方法主要分為手術方法及非手術方法[5，13]。對關節炎的檢驗評估方法也較多[14]。本研究采用的Ⅱ型膠原酶注射法及石膏固定法均操作簡單，應用多種方法進行綜合評估。Ⅱ型膠原酶注射法能夠在短期內造模成功，需要時間較短，一般3周左右即可，延長造模時間對于該動物模型意義不大，主要表現為早中期骨關節炎改變。石膏法造模所需時間較長，約12周左右，隨著時間的延長，骨關節炎的程度逐漸加重。在造模的不同階段可以顯示不同時期的骨關節炎改變，在病理學改變上更加符合骨關節炎的病理學特征。

X線片檢查是骨關節炎診斷的金標準，但缺乏敏感性[15]。常用于骨關節炎動物模型的評估[16]。因X線片對于軟骨組織顯示的欠缺，僅對關節間隙及周圍增生骨贅情況的進行評估。本研究中犬膝關節X線片檢查不能準確反映關節炎的情況，在病理顯示為骨關節炎晚期的模型中，其X線仍不典型。因此，X線片可作為診斷標準之一，但尚不足作為一個評判標準。在動物模型的評估中MRI檢查更準確，敏感性高。它不僅顯示關節軟骨，對于半月板、韌帶、關節滑膜等組織均可以清晰顯示，在骨關節炎不同時期均有典型表現[17-18]。將滑膜增厚、軟骨變薄、侵蝕、軟骨下骨病變、關節積液等情況直觀的顯示出來。在本研究中，造模12周后藥物組多處于骨關節炎早中期，而石膏組多處于中晚期。在MRI圖像上對于早期滑膜的病變、關節積液、關節軟骨下病變均有清晰的顯示，而在中晚期可以見軟骨變薄、軟骨下骨囊性變等特征性改變。與段鑫等[19]的研究結果相符。且相對于手術造模方法，本研究所示的骨關節炎表現更加符合人退行性骨關節炎的特征。病理學檢查作為大多數疾病診斷的“金標準”，在骨關節炎動物模型中得到廣泛的應用[20]。病理學檢查可以從細胞層面把軟骨細胞、膠原纖維、黏多糖、潮線、血管長入等改變清楚的呈現出來[21-24]，且對于骨關節炎病理學分級分期更靈敏、有效。在本研究的病理學檢查中出現軟骨細胞減少、排列紊亂、成簇生長；膠原纖維染色不均勻且染色變淡；黏多糖減少，尤其是在中重度骨關節炎中；潮線的上移、模糊不清、甚至消失；團塊狀的血管長入等，以上這些都是在骨關節炎不同時期的典型表現。

KOA的發病目前認為與軟骨及軟骨下骨的損傷密切相關[4，25-28]。在本研究中MRI及病理學檢查均發現軟骨及其周圍的病變。各期關節炎的典型表現均可見到。有研究表明關節炎的發生與血管長入及血管翳形成有關，而本研究在對血管基質的Ⅳ型膠原蛋白染色中也得到了證實[21]。

綜上所述，Ⅱ型膠原酶注射法及石膏固定法均可成功制備犬KOA動物模型。在非手術方法中較為簡便實用，各有優劣，在造模的不同時間段可以表現出不同程度的典型病理形態。為KOA的發病機制及診療研究提供了良好的實驗條件，奠定了研究基礎。