丹參酮IIA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化C57小鼠血脂水平的影響觀察

羅炬輝 陳友權(quán) 何德全 龍信聰

1.廣州市白云區(qū)第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東廣州 510450；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科，廣東廣州 510150；3.廣州市白云區(qū)第二人民醫(yī)院內(nèi)科，廣東廣州 510450

動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈血管發(fā)生炎癥后出現(xiàn)的一種疾病，近年來(lái)臨床上較為常見(jiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化會(huì)發(fā)生血管內(nèi)皮障礙、炎癥因子激活后一系列炎癥反應(yīng)、血脂脂質(zhì)混亂，形成血栓等[1]，是很多心腦血管疾病的基礎(chǔ)疾病，如缺血性腦卒中、冠心病、心力衰竭等一系列疾病。丹參酮IIA是一種近年來(lái)較為熱點(diǎn)的丹參酮型的二萜類(lèi)化合物，是丹參中較為重要的脂溶成分[2]，主要提取于丹參，有研究顯示丹參酮IIA，具有優(yōu)越的生理活性，在抗炎及抑菌、清除自由基、抗氧化方面保護(hù)肝臟，并具有改善功能、抗癌、改善血液循環(huán)等功效，其對(duì)心腦血管的作用為目前臨床研究熱點(diǎn)[3-4]。因此，本研究就丹參酮IIA 對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化C57小鼠血脂水平影響進(jìn)行探究，如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性C57大鼠30只，體重180～220g，無(wú)任何頭部頸部淤血等外傷。購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：XYZW（粵）2017-2021。大鼠分籠飼養(yǎng)、自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)研究時(shí)間為2019年4～10月，實(shí)驗(yàn)均經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，本實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)（IASP）關(guān)于進(jìn)行動(dòng)物疼痛實(shí)驗(yàn)的綱要實(shí)施完成[5]。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分3組，每組10只。

1.2 藥品、試劑及儀器

丹參酮IIA（上海上藥第一生化，批號(hào)：1903104），ELISA試劑盒（美國(guó)BOSTER公司，貨號(hào)：EK0411、A00101、EK0527），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自（Promega公司，貨號(hào)：A5001），TB GreenTMPremix ExTaq Ⅱ試劑盒購(gòu)自（TakaRa公司，貨號(hào)：RR820AA），PVDF膜（Millipore公司，貨號(hào)：IPVH00010），免疫組化試劑盒（北京中衫金橋，貨號(hào)：SPN-9001）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)照組：正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化造模、不給予丹參酮IIA；模型組：進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化造模但不給予丹參酮IIA；丹參酮組：進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化造模并給予丹參酮IIA。于造模后第7天，對(duì)照組正常喂養(yǎng)8周；模型組：腹腔注射生理鹽水，15mg/kg，1次/d，共8周；丹參酮組給予丹參酮IIA，腹腔注射 15mg/kg，1次/d，共8周。所有小鼠喂養(yǎng)8周后處死取材。

1.4 大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的制作[6]

對(duì)敲除apoE-/-（載脂蛋白E基因）的20只小鼠注射低劑量（2×10PFU）d的感染MCMV（低劑量巨細(xì)胞病毒），在慢性潛伏感染階段，MCMV感染可以明顯加重Apoe（載脂蛋白E）基因缺陷小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變，并使重度動(dòng)脈粥樣硬化病變提前出現(xiàn)。隨機(jī)分為模型組與丹參酮組，各10只。造模第7天隨機(jī)抽取模型組與丹參酮組大鼠，于眼眥取血后檢測(cè)血脂水平以判斷造模成功。

1.5 測(cè)定指標(biāo)

比較8周后，三組炎癥因子水平包含巨噬細(xì)胞包含白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、CD3，成熟T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志（T細(xì)胞）含量、血脂水平包含高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、三酰甘油（TG）、血清總膽固醇（TC）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究數(shù)據(jù)采用 SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，多組間及同組不同時(shí)間點(diǎn)的計(jì)量資料用（）表示，采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患者炎癥因子水平比較

與對(duì)照組比較，丹參酮組、模型組的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 三組患者炎癥因子水平比較（±s，pg/mL）

表1 三組患者炎癥因子水平比較（±s，pg/mL）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.001

組別 IL-6 IL-1β TNF-α丹參酮組 45.46±8.18* 19.27±2.35* 23.74±6.73*模型組 185.74±54.56* 33.21±12.20* 39.63±15.72*對(duì)照組 23.45±15.23 13.65±2.65 7.26±1.54 F 35.490 9.426 13.331 P＜0.001 ＜0.05 ＜0.05

2.2 三組患者巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞細(xì)胞含量比較

入組第1天三組的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模8周后，與對(duì)照組比較，丹參酮組、模型組的巨噬細(xì)胞百分比均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；造模8周后，與對(duì)照組比較，丹參酮組、模型組的CD3細(xì)胞百分比均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3 三組患者血脂水平比較

入組第1天三組的HDL-C、LDL-C、TG、TC上的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模1周后，與對(duì)照組比較，丹參酮組、模型組的HDL-C水平降低，LDL-C、TG、TC升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；造模8周后，對(duì)照組與丹參酮組的HDL-C水平較模型組均高于模型組，LDL-C、TG、TC水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

建立動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型中，大鼠具有可同時(shí)檢測(cè)多種指標(biāo)、價(jià)格低廉、血量豐富、免疫系統(tǒng)完善等優(yōu)點(diǎn)，C57小鼠在引發(fā)誘導(dǎo)性肥胖、2型糖尿病及粥樣動(dòng)脈硬化等有明顯優(yōu)勢(shì)，因此本研究就用C57大鼠建立動(dòng)脈粥樣硬化模型[7-8]，研究丹參酮IIA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化血脂水平的影響觀察。有研究顯示，當(dāng)血脂含量過(guò)高時(shí)，血脂依附于血管后會(huì)在血管壁形成脂質(zhì)條紋，沉積過(guò)多后造成血管堵塞或血管狹窄[9]。一般情況下LDL會(huì)進(jìn)入系膜區(qū)后，由系膜細(xì)胞或吞噬細(xì)胞通過(guò)其表面受體進(jìn)行清除，但如果沉積程度超過(guò)LDL的清除能力，就會(huì)造成脂蛋白沉積發(fā)生，加重動(dòng)脈粥樣硬化的病變程度[10]。

表2 三組患者巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞細(xì)胞含量比較（±s，%）

表2 三組患者巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞細(xì)胞含量比較（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，*P＞0.05，#P＜0.001，@P＞0.05

組別 巨噬細(xì)胞 T細(xì)胞（CD3）含量第1天 1周后 8周后 F P 第1天 1周后 8周后 F P丹參酮組B2.43±0.48* 1.45±0.12# 2.34±0.45@ 19.680 ＜0.01 68.36±2.51* 85.45±1.54# 72.44±0.32# 272.378 ＜0.01模型組A 2.39±0.95* 1.44±0.13# 1.31±0.09# 11.244 ＜0.01 68.41±2.43* 85.33±1.48# 85.21±1.34# 287.406 ＜0.01對(duì)照組 2.37±0.85 2.41±0.52 2.45±0.48 0.039 ＞0.05 68.45±2.25 69.33±2.77 69.45±2.16 0.514 ＞0.05 F 0.015 30.868 26.900 0.003 210.819 320.244 P＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01

表3 三組患者血脂水平比較 （±s）

表3 三組患者血脂水平比較 （±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＞0.05，#P＜0.05，@P＞0.05，&P＜0.01

組別 HDL-C（mmol/L） LDL-C（mmol/L）第1天 1周后 8周后 F P 第1天 1周后 8周后 F P丹參酮組B 1.85±1.37* 0.98±0.25# 1.83±0.87@ 2.744 ＞0.05 2.54±0.55* 3.55±0.52& 2.28±0.24@ 21.416 ＜0.05模型組A 1.84±1.35* 0.96±0.21# 1.35±0.65@ 2.548 ＞0.05 2 .54±0.48* 3.41±0.55& 3.29±0.49@ 8.627 ＜0.01對(duì)照組 1.85±1.44 1.83±1.21 1.85±0.94 0.000 ＞0.05 2.54±0.53 2.55±0.52 2.45±0.38 0.131 ＞0.05 F 0.000 4.711 1.165 0.000 10.431 19.844 P＞0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01組別 TG（mmol/L） TC（mmol/L）第1天 1周后 8周后 F P 第1天 1周后 8周后 F P丹參酮組 1.41±0.48* 2.75±0.51& 1.42±0.31@ 30.384 ＜0.05 4.38±0.64* 6.87±0.95& 4.31±0.68@ 35.950 ＜0.05模型組 1.41±0.46* 2.79±0.53& 2.67±0.41& 26.540 ＜0.05 4.40±0.56* 7.15±1.12& 6.79±1.21& 22.104 ＜0.05對(duì)照組 1.40±0.49 1.42±0.51 1.38±0.56 0.015 ＞0.05 4.41±0.62 4.45±0.57 4.39±0.62 0.026 ＞0.05 F 0.002 22.765 27.935 0.006 26.644 25.784 P＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01

本研究顯示，造模后的小鼠出現(xiàn)炎癥因子水平升高、巨噬細(xì)胞、CD3細(xì)胞百分比均減少等情況，給予丹參酮IIA 8周后的小鼠炎癥因子水平較注射生理鹽水的小鼠，炎癥因子水平恢復(fù)至與對(duì)照組持平的水平，原因可能為動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，炎癥因子、黏附分子等表達(dá)增加，驅(qū)使炎癥細(xì)胞向動(dòng)脈內(nèi)膜遷移，加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展，并且炎癥細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附是炎癥反應(yīng)發(fā)生關(guān)鍵步驟之一[11-12]。增多的黏附分子募集更多炎癥細(xì)胞向動(dòng)脈內(nèi)膜遷移后加速血管內(nèi)皮的損傷，被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)[13-14]。而研究結(jié)果顯示丹參酮 IIA 能減少血管中炎癥因子的表達(dá)，從而減少炎癥細(xì)胞及黏附分子的表達(dá)及遷移，以降低動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)行與發(fā)展。本研究結(jié)果還顯示，使用丹參酮IIA 的小鼠的HDL-C高于注射生理鹽水的小鼠，LDL-C、TC、TG水平低于注射生理鹽水的小鼠，原因?yàn)長(zhǎng)DL為人體內(nèi)膽固醇運(yùn)輸?shù)闹饕d體，血管中的TC 和LDL升高，人體內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激后，產(chǎn)生大量的自由基后LDL就會(huì)被氧化產(chǎn)生脂蛋白（Ox-LDL），Ox-LDL的不斷增加則會(huì)使血管內(nèi)皮受到損傷，使炎癥反應(yīng)就一步加重，丹參酮IIA在被吸收后減少血管中Ox-LDL的生成，因此LDL-C、TC、TG水平均呈下降，對(duì)血管內(nèi)皮起到一定的保護(hù)作用，加之對(duì)炎癥細(xì)胞等細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，對(duì)粥樣動(dòng)脈硬化的炎癥反應(yīng)起到一定抑制作用[15]。因此隨著炎癥因子被抑制，體細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子也降低趨勢(shì)，隨之巨噬細(xì)胞恢復(fù)正常水平。

綜上所述，丹參酮IIA可以保護(hù)動(dòng)脈內(nèi)皮功能，降低動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的炎癥反應(yīng)，恢復(fù)免疫系統(tǒng)的同時(shí)改善血脂水平。