綠原酸治療口腔潰瘍的動物實驗研究

劉錦婷 張 澤 林 靜 李胤宏 羅廷炎 陳巧妮 顧 瑜，▲ 白國輝

1.遵義醫科大學珠海校區口腔醫學系，廣東珠海 519041；2.貴州省高等學校口腔疾病研究特色重點實驗室，貴州遵義 563000

[關鍵字] 口腔潰瘍；綠原酸；腫瘤壞死因子α；超氧化物歧化酶

復發性口腔潰瘍（recurrent oral ulcer，ROU）是最常見的口腔黏膜病，患病率可高達50%。ROU表現為圓形或橢圓形潰瘍，具有“黃、紅、凹、痛”的臨床特點。本病具有自限性、復發性、周期性的特征，發作時疼痛明顯，影響進食、言語等日常行為。目前病因和發病機制尚未明確，研究顯示ROU的發生發展與病毒或細菌感染、自身免疫、營養缺乏、精神心理、遺傳及免疫失調等有關。目前臨床上一般以改善疼痛的對癥治療為主[1]，尚缺乏有效地根治方法。

綠原酸（chlorogenic acid，CGA）是奎尼酸與反式肉桂酸縮合而成的酯類化合物，廣泛存在于高等雙子葉植物和蕨類植物中，CGA便宜易得、綠色安全，并且具有抗氧化、抗菌、抗突變和抗癌變、降血脂和降血壓、保護心血管和中樞神經、抑制糖尿病、抗紫外線和抗輻射、抗白血病、免疫調節、細胞保護、保肝、抗內毒素等多方面的藥理作用[2-4]。研究發現，CGA可減少硫酸葡聚糖誘導的結腸黏膜損傷[5]。但尚未見其促進口腔潰瘍的相關研究。本課題通過構建大鼠口腔潰瘍動物模型，予以不同濃度CGA處理口腔潰瘍后，觀察CGA對大鼠口腔潰瘍的療效，及對細胞炎癥因子及氧化應激因子的影響，為CGA治療ROU的實驗研究和臨床應用提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠72只，雌性，體重240～260g，購于湖南長沙實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK（湘）2019-0014。實驗開始前適應性飼養3d，飼養于遵義醫科大學實驗動物中心［室溫（22±1）℃，相對濕度30%～60%，12h光照/12h黑暗］，大鼠自由攝食和飲水。

1.1.2 藥品及試劑 綠原酸（批號：K200V08，酷爾化學科技有限公司）；腫瘤壞死因子（TNF-α）試劑盒（批號：20191101，南京建成生物工程研究所），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號：20191031，南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立大鼠ROU模型 用10%水合氯醛（0.3mL/100g）腹腔注射麻醉大鼠后，將浸透飽和NaOH溶液的濾紙片（3mm×3mm）分別置于大鼠左右兩側頰黏膜20s，所有大鼠均在同一部位做相同處理。24h后大鼠口腔黏膜出現明顯的潰瘍面，肉眼觀察可見潰瘍中央凹陷，上覆黃白色假膜，周圍充血水腫，顯示建模成功。

1.2.2 分組及給藥 建模成功后，將72只SD大鼠隨機分為四組，每組18只，分為對照組及高、中、低濃度組。其中對照組左右兩側潰瘍面不予以任何處理；高、中、低濃度組給藥濃度分別為10.0、5.0、2.5mg/mL綠原酸溶液。建模后第2天開始給藥，每日用棉簽吸附20μL相應藥物作用于左右兩側潰瘍面1min，早晚各1次，給藥后30min禁食禁水。

1.3 樣本采集

分別于首次給藥后第3、5、7天每組隨機選出6只大鼠，麻醉后使用真空采血管經腹主動脈采集血液樣本，高速離心后將血清-80℃冰箱保存備用。然后處死大鼠，完整取下潰瘍黏膜及肌層。

1.4 觀察指標

1.4.1 潰瘍面積的測定 用游標卡尺測量0、3、5、7d的大鼠口腔潰瘍最大橫徑（d1）和最大縱徑（d2），單位為mm，因潰瘍多為橢圓形，所以可參照橢圓面積計算公式計算潰瘍面積（潰瘍面積=π×d1×d2×1/4，π取值3.14），單位為mm2。

1.4.2 病理學觀察 將取下的第3、5、7天的潰瘍組織于4%多聚甲醛固定24h后，依次經過脫水，包埋，切片，HE染色，封片后制作成切片，光鏡下觀察組織病理學的變化。

1.4.3 血清中TNF-α、SOD的測定 將采集的血清樣本，于4℃靜置2h后，4℃，3000r/min離心10min，取上清按照試劑盒說明書使用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD水平。采用ELISA法測定四組血清TNF-α水平，操作過程嚴格按照說明書進行。檢測步驟為2倍倍比稀釋標準品、加標準品、加樣本和二抗、加酶溫育30min，配洗液并洗板，避光顯色10min，加終止液。檢測因子在加入終止液的5～30min內均在450nm處檢測OD值，最后根據標準曲線計算血清中細胞因子的含量。

1.5 統計學分析

應用SPSS22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 綠原酸對大鼠口腔潰瘍變化的影響

實驗第3天，與對照組比較，高濃度組潰瘍明顯減小，差異有統計學意義（P＜0.05）；第5天，高濃度組和中濃度組潰瘍與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；第7天，高、中、低濃度組的潰瘍面積與對照組比較均明顯減小，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 綠原酸對大鼠口腔潰瘍組織病理變化的影響

給藥第3天，對照組潰瘍表面仍可見覆蓋較厚的黃白色假膜，低濃度組潰瘍表面可見部分假膜覆蓋，而中高濃度組潰瘍表面假膜基本脫落；對照組鏡下觀可見黏膜上皮溶解、脫落，固有層中膠原纖維破壞消失，有大量炎癥細胞浸潤，以中性粒細胞和淋巴細胞為主。與對照組比較，各濃度組的固有層炎癥細胞明顯減少，毛細血管增生明顯。第5天，對照組仍有少量炎癥細胞浸潤，而各濃度給藥的上皮修復基本完整。第7天，各濃度組潰瘍范圍不明顯，基本痊愈，鏡下各組上皮修復基本完成。見圖2。

圖1 綠原酸對大鼠的潰瘍面積的影響

圖2 綠原酸對大鼠口腔潰瘍組織病理變化的影響（HE×200）

2.3 綠原酸對大鼠血清中SOD活性的影響

首次給藥后第3、5、7天，低、中、高濃度組的SOD活性與對照組比較均有明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 四組口腔潰瘍大鼠血清SOD水平比較（±s，IU/L）

表1 四組口腔潰瘍大鼠血清SOD水平比較（±s，IU/L）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 n 給藥第3天 給藥第5天 給藥第7天對照組 6 94.55±1.07 94.70±1.99 100.33±0.58低濃度組 6 98.65±3.59* 101.60±1.80* 103.30±0.98*中濃度組 6 99.66±0.65* 103.90±2.23* 105.40±1.46*高濃度組 6 101.10±1.28* 104.50±1.31* 108.20±2.33*F 11.812 35.101 30.534 P 0.003 0.000 0.000

2.4 綠原酸對大鼠血清中TNF-α水平的影響

首次給藥后第3、5、7天，低、中、高濃度組的TNF-α活性均明顯降低，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 四組口腔潰瘍大鼠血清TNF-α水平比較（±s，ng/dL）

表2 四組口腔潰瘍大鼠血清TNF-α水平比較（±s，ng/dL）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 n 給藥第3天 給藥第5天 給藥第7天對照組 6 24.14±0.96 16.40±1.11 9.26±0.93綠原酸組 6 16.32±0.43* 9.86±1.40* 4.59±0.85*綠原酸組 6 14.42±0.89* 9.19±1.09* 2.08±0.87*綠原酸組 6 8.16±1.33* 7.67±0.88* 1.37±0.63*F 284.105 69.403 111.529 P 0.000 0.000 0.000

3 討論

ROU是口腔科就診中常見且多發的口腔黏膜疾病，臨床上尚無理想的根治方法，目前主要以消炎止痛等對癥治療為主，因此尋找對該病治療有效的藥物成為近年研究熱點。目前中藥在治療口腔潰瘍的方面上取得了不錯的效果，研究表明導赤散加金因肽能下調血清VEGF，TNF-α水平，促進口腔潰瘍愈合，減少潰瘍復發，療效可靠[6]。CGA是一種從雙子葉植物中分離得到的酚類，也是許多中草藥及中藥復方制劑的主要活性成分，在杜仲、金銀花、向日葵、可可樹中含量較高，具有抗炎、抗氧化和促愈合的作用[7-8]。本實驗結果顯示，在ROU大鼠模型中，與對照組比較，高、中、低濃度CGA處理后的口腔的潰瘍面積均減小。其中，高濃度組第3天起潰瘍明顯減小，與對照組比較差異有統計學意義；中濃度組第5天起，與對照組比較差異有統計學意義，第7天，低濃度組與對照組比較差異有統計學意義。以上結果初步證實CGA能明顯促進口腔潰瘍愈合，且與濃度相關，一定劑量的前提下濃度越高愈合效果越好。

近年來，炎癥因子與ROU的關系成為國內外學者關注的焦點。TNF-α是炎癥發生過程中的關鍵細胞因子，通過對內皮細胞黏附功能的影響及誘導中性粒細胞趨化來啟動炎癥反應[9-11]。王藝衡等[12]提出TNF-α可誘導包括自身在內的多種細胞因子活化，促使口腔黏膜上皮淋巴細胞的增殖、分化和移行，這一過程釋放大量特異性或非特異性炎癥因子，引起局部免疫破壞，故其是評判口腔潰瘍嚴重程度的重要指標。周英等[13]發現，CGA可以通過抑制TNF-α、IL-6等細胞炎癥因子和花生四烯酸代謝途徑的關鍵酶COX-2的活性來抑制炎癥反應發生。本研究顯示，相對于對照組，不同濃度實驗組中固有層炎癥細胞明顯減少，TNF-α水平明顯降低，表明CGA可能通過抑制炎癥因子水平從而加速潰瘍黏膜的修復。

口腔潰瘍的發生發展還可能與氧自由基的增多相關[14]。楊剴舟[15]證實CGA具有良好的抗氧化活性，能夠清除多種化學類自由基和活性氧自由基。本實驗顯示，與對照組比較，各實驗組SOD活性明顯升高。徐建升[16]發現SOD可以通過清除體內的自由基進而保護細胞，SOD是抗氧化酶體系的重要組成成分，其水平的高低能夠體現口腔潰瘍的愈合速率，表明CGA可能通過增高SOD活性從而加速潰瘍黏膜的修復。

綜上所述，CGA可有效地降低ROU大鼠血清中TNF-α水平，升高SOD水平，從而達到治療ROU的作用，療效顯著，但遠期療效以及治療最佳濃度的確定還有待進一步研究。