夜香牛不同提取部位木犀草素的含量測定及體外抗氧化活性研究

韋志英 何家慧 趙 河 潘小姣▲

1.廣西中醫藥大學實驗實訓中心，廣西南寧 530200；2.廣西中醫藥大學藥學院，廣西南寧 530200

夜香牛為壯族民間常用藥，是菊科（Compositae）斑鳩菊屬（Vernonia Schreb）植物夜香牛[Vernonia Cinerea（L.）Less.]的全草，在《嶺南采藥錄》中對其有比較早的記載[1-2]。夜香牛全草均可藥用，在我國的華東和華南地區廣泛分布，在日本、非洲以及印度等國家也有分布，常見于路邊、田野、荒地以及山坡等[3]。夜香牛味苦、辛，性涼，有清熱疏風、除濕解毒之功效，在民間主要用于治療感冒發熱、毒蛇咬傷、黃疸型肝炎等病癥[4]。

有文獻研究表明[5-8]，夜香牛具有降血糖、抗菌和抗腫瘤等多種藥理作用。夜香牛全草含有的藥理活性化學成分主要有黃酮類、倍半萜類以及三萜類化合物等，其中木犀草素是夜香牛含有的黃酮類化合物之一[9-13]。大量文獻研究表明，木犀草素具有抗菌、抗輻射、抗腫瘤等多種藥理作用[14-15]。曾有文獻對廣西不同產地夜香牛所含的木犀草素進行了含量測定[16]，但是目前尚無文獻對夜香牛不同提取部位的木犀草素進行含量測定，亦沒有其抗氧化活性的研究報道。在本研究中，筆者擬比較夜香牛不同提取部位木犀草素含量的高低，并對其不同提取部位進行體外抗氧化活性研究，為夜香牛資源的有效利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司，Agilent1260）；電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司，SQP）；雙束光紫外可見分光光度計（島津儀器有限公司，UV-1780）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-500E）。

1.2 試藥

夜香牛藥材于2018年10月在廣西梧州市藤縣采集，經廣西中醫藥大學藥用植物教研室郭敏副教授鑒定為夜香牛[Vernonia Cinerea（L.）Less.]的全草，藥材經自然陰干后，粉碎，過40目篩，密封保存，備用；木犀草素對照品（上海融禾醫藥科技有限公司，含量≥98%，生產批號：171026）；維生素C（VitC）對照品（北京索萊寶科技有限公司，含量≥98%，生產批號：105N032）；DPPH（東京化成工業株式會社，含量≥98%，生產批號：464RB-GE），其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 木犀草素含量測定

2.1.1 含量測定溶液的制備 （1）對照品溶液的制備：取木犀草素對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成濃度為0.042mg/mL的木犀草素對照品溶液，過0.45μm微孔濾膜，于4℃保存，備用。

（2）藥材供試品溶液的制備：取夜香牛粉末約10.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100mL，稱定總重量，超聲提取（功率：300W，頻率：45kHz）30min，用甲醇補重，取上清液過0.45μm微孔濾膜，即得。

（3）各提取部位供試品溶液的制備：取夜香牛粉末10.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇100mL，超聲提取（功率：300W，頻率：45kHz）30min，過濾，濾液減壓回收甲醇，殘渣用真空干燥至恒重，浸膏稱定重量，加入50mL純水，超聲溶解后轉移至分液漏斗中，先后分別用50mL石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各振搖萃取10min，分出各萃取部位，分別減壓回收溶劑，殘渣置真空干燥至恒重，浸膏稱定重量，分別用甲醇超聲溶解，并定容至10mL，取上清液過0.45μm微孔濾膜，即得各提取部位的供試品溶液。

2.1.2 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：Thermo Scientific Acclaim TM120-C18（5μm，4.6mm×250.0mm），流動相：0.4%磷酸（A）-甲醇（B），梯 度 洗 脫（0～22min：35%→35%B，22～27min：35%→45%B，27～70min：45%→45%B）；流 速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：360nm；進樣量：10μL。在此色譜條件下，木犀草素峰形良好，與相鄰峰間的分離度＞1.5，理論板數以木犀草素峰計不低于2000。高效液相色譜圖見圖1。

2.1.3 線性關系考察 按“2.1.2”項下的色譜條件，將木犀草素對照品溶液分別以1、4、8、12、14、16μL分別進樣測定，以木犀草素進樣量x（μg）為橫坐標，以其峰面積為縱坐標y，做線性回歸，得到線性方程為y=4839.4x-31.966（r=0.9999）。結果表明，木犀草素在0.042～0.672μg的進樣量范圍內與其峰面積呈良好的線性關系。

2.1.4 精密度試驗 取木犀草素對照品溶液，按“2.1.2”項下的色譜條件進樣測定，重復進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，木犀草素峰面積的RSD=0.17%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 取“2.1.1（2）”項下制備的夜香牛藥材供試品溶液，分別于室溫條件下放置0、4、8、12、24、48h后，然后按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，木犀草素峰面積的RSD=1.47%（n=6），表明藥材供試品溶液在室溫條件下放置48h，木犀草素基本穩定。

2.1.6 重復性試驗 取夜香牛藥材粉末10.0g，精密稱定，共6份，分別按“2.1.1（2）”項下的方法制備藥材供試品溶液，然后按“2.1.2”項下的色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并用外標一點法計算木犀草素含量。結果顯示，木犀草素含量的RSD=2.16%（n=6），表明此方法重復性良好。

圖1 各提取部位高效液相色譜圖

2.1.7 加樣回收率試驗 取已知含量的夜香牛藥材粉末6份，每份約5.0g，精密稱定，按已知量的100%加入木犀草素對照品，再分別按“2.1.1（2）”項下的方法制備藥材供試品溶液，然后按“2.1.2”項下的色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算木犀草素的加樣回收率。結果顯示，木犀草素的平均回收率為96.81%，RSD=1.22%（n=6）。加樣回收率測定結果見表1。

2.1.8 樣品含量測定 分別按“2.1.1（2）和（3）”項下方法制備夜香牛藥材和各提取部位的供試品溶液，每個樣品平行制備3份，然后按“2.1.2”項下的色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算各供試品中木犀草素的含量。結果表明，在各提取部位中，乙酸乙酯部位的木犀草素含量最高（1.0141mg/g），而水部位沒有發現木犀草素。含量測定結果見表2。

2.2 夜香牛不同提取部位的體外抗氧化活性測定

2.2.1 體外抗氧化試驗各供試品溶液的制備 （1）VitC對照溶液的制備：取VitC對照品適量，用甲醇分別配置成0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg/mL的溶液，備用。

（2）不同提取部位供試品溶液的制備：按“2.1.1（3）”項下的方法制備得到甲醇總提取物和各提取部位浸膏，分別取浸膏適量，用甲醇配置成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的溶液，備用。

2.2.2 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除試驗[17]分別取不同濃度的供試品溶液和VitC對照溶液各2.0mL，加入2mL 2.0mmol/L的DPPH甲醇溶液，于暗處放置15min，在520nm處測定吸光度，作為樣品組（A樣）；用甲醇代替DPPH，按照上述相同方法測定吸光度，作為溶劑對照組（A對）；用甲醇代替樣品，按照上述相同方法測定吸光度，作為空白組（A空）。各供試品對DPPH自由基的清除率按照下式計算：DPPH自由基清除率（%）=[1-（A樣-A對）/A空]×100%。每種供試品平行檢測3次。采用SPSS23.0統計學軟件計算各供試品對DPPH自由基的半數清除濃度（IC50），數據均以（）表示，IC50越小表明清除能力越強，并對結果進行方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

表1 加樣回收率測定結果（n=6）

表2 各提取部位木犀草素含量測定結果（n=3）

結果表明，DPPH自由基清除能力的強弱排序為乙酸乙酯部位＞甲醇總提取物＞水部位＞正丁醇部位＞石油醚部位，其中甲醇總提取物和乙酸乙酯部位對DPPH自由基清除能力與VitC相當，差異無統計學意義（P＞0.05）。抗氧化活性結果見表3。

2.2.3 羥自由基清除試驗[18]分別取不同濃度的供試品溶液和VitC對照溶液各2.0mL，先加入7.5mmol/L鄰二氮菲試劑1mL，0.2moL/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）4mL，混勻后加入7.5mmol/L FeSO4溶液2mL，0.1% H2O2溶液0.2mL，混勻后置37℃水浴60min，于波長536nm處測定吸光度，所得數值記為As；以純水代替H2O2所測得的吸光度記為Ab；以甲醇代替樣品，所測得的吸光度記為Ap。清除率計算公式如下：羥自由基清除率（%）=[（As-Ap）/（Ab-Ap）]×100%。每種供試品平行檢測3次。采用SPSS23.0統計學軟件計算各供試品對羥自由基的半數清除濃度（IC50），數據均以（）表示，IC50越小表明清除能力越強，并對結果進行方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結果表明，羥自由基清除能力的強弱排序為乙酸乙酯部位＞甲醇總提取物＞正丁醇部位＞水部位＞石油醚部位，并且甲醇總提取物和乙酸乙酯部位對羥自由基的IC50與VitC比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。抗氧化活性結果見表3。

表3 夜香牛不同提取部位對DPPH自由基和羥自由基的清除活性比較（±s，mg/mL，n=3）

表3 夜香牛不同提取部位對DPPH自由基和羥自由基的清除活性比較（±s，mg/mL，n=3）

注：在同一指標不同組別間，與其他各組（除VitC組外）比較，aP＜0.05；與VitC組比較，bP＜0.05

樣品 DPPH自由基IC50 羥自由基IC50甲醇總提取物 0.107±0.005 5.687±0.976石油醚部位 10.419±1.356ab 78.732±5.088ab乙酸乙酯部位 0.089±0.008 1.484±0.252正丁醇部位 0.328±0.025b 21.355±2.103b水部位 0.317±0.087b 24.385±1.824b VitC 0.116±0.006 0.051±0.004 F 983.771 349.892 P＜0.01 ＜0.01

3 討論

在體外抗氧化試驗中，筆者還曾嘗試用鄰苯三酚法考察各供試品對超氧陰離子自由基的清除能力，但是由于反應溶液出現大量的絮狀沉淀，無法準確地測定結果，因而沒有得到相關的實驗數據。體外抗氧化試驗一般是在可見光區檢測反應溶液的吸光度，試驗過程中需要注意以下三點：其一，測定溶液必須處于澄清狀態，不能存在絮狀沉淀，否則測定光線會被阻斷，嚴重影響測定結果的準確性；其二，嚴格控制反應時間、溫度和緩沖鹽濃度等實驗條件，確保每種樣品的測定條件相同，盡量減小實驗誤差；其三，要根據試驗原理先進行預試驗，調整各種反應試劑的加入量，使所檢測到的吸光度值最好位于0.2～0.8之間。因為，紫外-可見分光光度計存在一定的暗噪聲，吸光度值過大或過小都會影響實驗的準確性。

本實驗結果表明，與其他提取部位相比，乙酸乙酯部位對DPPH自由基和羥自由基的清除活性最強，其清除活性與VitC相當。而乙酸乙酯部位中木犀草素的含量最高，故其對兩種自由基的清除能力與木犀草素含量呈一定的正性相關。由于甲醇總提取物對這兩種自由基的清除能力也不錯，但是其木犀草素的含量卻低于活性較差的正丁醇部位。故可以推測，在甲醇總提取物和乙酸乙酯部位還含有除木犀草素之外的其他抗氧化活性成分。這些未知的抗氧化活性成分在甲醇總提取物和乙酸乙酯部位的含量均較高，亟待進一步對其進行深入的研究。本研究結果對今后開發和利用夜香牛藥材提供了一定的實踐指導意義。