海藻多糖急性毒性試驗考察

范文彤

天津生物化學制藥有限公司品質部，天津 300308

海洋藻類植物極其豐富，海藻中包括兩種生物活性物質，一種分子量較小，吸收后能直接或間接影響體內代謝，主要包括鹵族化合物、萜類化合物、溴酚類化合物、對苯二酚、海藻單寧、昆布氨酸等；另一種是難以被消化吸收的細胞間粘性多糖，主要包括褐藻中的藻酸、褐藻糖膠、硫酸多糖、紅藻中的瓊膠、卡拉膠等[1]。海藻多糖屬于第一種生物活性物質，是海藻中含量較高的成分之一，許多研究已經證明海藻多糖不僅具有抗腫瘤和抗病毒的功能[2]，還具有抗凝血、抗氧化及降血脂與將血膽固醇等功能[3]，另據相關文獻報道其還可用于感染性疾病的預防和治療[4]。尤其是近年來，國內外專家們雖均致力于海藻多糖的藥理功能、生物活性功能的研究，并且取得了長足的發展，可是對于其藥理學、毒理學方面的研究報道卻很少，為此，筆者考察了海藻多糖的急性毒性即先對小鼠及大鼠灌胃給予最大體積、最大濃度海藻多糖，進行半數致死量（LD50）考察，如試驗不能確定LD50，則對小鼠及大鼠灌胃給予最大體積、最大濃度海藻多糖，進行最大耐受劑量考察，通過觀察給藥后海藻多糖對小鼠、大鼠急性毒性的影響，得出最大耐受量，以期為臨床藥理學及臨床安全用藥提供試驗數據支持與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 受試藥物 海藻多糖：供試藥，深棕色粉末，由天津生物化學制藥有限公司公司制備后提供（取中藥海藻洗凈去雜質，鼓風干燥后粉碎，1倍量蒸餾水浸泡3h，棄初浸液，復加9倍量蒸餾水浸泡3h，回流提取4次，首次提取時間為6h，后3次每次提取時間為4h，棄中藥殘渣合并提取液，減壓濃縮，濃縮液加95%醇沉，醇沉液濃度為73%，靜置24h，離心，棄上清取沉淀真空干燥，即得粗品；取粗品粉碎后，加無水乙醇醇洗4次，真空烘干粉碎后，即得精品，精品為深棕色粉末；取精品粉碎后，加入活性炭脫色，經透析及再次醇沉后，真空烘干粉碎，即得純品，純品為白色或類色粉末，由于純品制得收率較低且一般用作對照品應用于理化分析使用，故本試驗采用精品進行試驗考察[5]），批號為091005，含量為64%(以海藻多糖計)，臨用前以3%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或蒸餾水配制成最大濃度的混懸液，供灌胃使用。

1.1.2 供試動物 小鼠，昆明種，雌雄各半，體重18～21g，由天津藥物研究院動物研究室繁殖，“試驗動物設施合格證”由天津實驗動物管理委員會頒發，符合一級標準，正常飼養3d后供試。大鼠，Wister，雌雄各半，體重160～220g，由天津藥物研究院動物研究繁殖，“試驗動物設施合格證”由天津實驗動物管理委員會頒發，符合一級標準。正常飼養7d后供試。

1.1.3 試驗試劑 蒸餾水，天津生物化學制藥有限公司依據中國藥典2015年版要求，由飲用水經純化蒸餾后制得，符合藥典標準。注射用水，天津生物化學制藥有限公司依據中國藥典2015年版要求，由飲用水經純化蒸餾后制得，符合藥典標準[6]。

1.2 方法

1.2.1 海藻多糖對小鼠及大鼠LD50試驗

1.2.1.1 小鼠LD50試驗 健康昆明種小鼠40只，雌雄各半，按體重、性別隨機分成4組，每組10只，海藻多糖試驗組在禁食16h后，每一次灌胃給藥最大體積（0.8mL/20g體重），最大濃度（1.5g/mL）海藻多糖，每8小時灌胃1次，共灌服3次，空白對照組按相同試驗條件與方法給予等容積注射用水。灌胃后的小鼠正常飼養，觀察并記錄7d內4組小鼠的生理反應、行為活動，中毒癥狀及死亡情況。

1.2.1.2 大鼠LD50試驗 健康大鼠40只，雌雄各半，按體重、性別隨機分成4組，每組10只，海藻多糖試驗組在禁食16h后，每次灌胃給藥最大體積（1mL/100g體重)，最大濃度(3g/mL)海藻多糖，每8小時灌胃1次，共灌服3次，空白對照組按相同試驗條件與方法給予容積注射用水。灌胃后的大鼠正常飼養，觀察并記錄 7d內4組大鼠的生理反應、行為活動，中毒癥狀及死亡情況。

1.2.2 海藻多糖最大耐受劑量試驗

1.2.2.1 小鼠最大耐受劑量試驗 健康昆明種小鼠40只，雌雄各半，按體重、性別隨機分成4組，每組10只，海藻多糖試驗組在禁食16h后，每次灌胃給藥最大體積（0.8mL/20g體重），最大濃度（0.15g/mL）海藻多糖，每8小時灌胃1次，共灌服3次，空白對照組按相同試驗條件與方法給予等容積注射用水。灌胃后的小鼠正常飼養，觀察并記錄7d內4組小鼠的生理反應、行為活動，中毒癥狀、記錄小鼠7d內體重增長情況及死亡情況。7d后將小鼠處死，肉眼觀察小鼠主要內臟變化情況。

1.2.2.2 大鼠最大耐受劑量試驗 健康大鼠40只，雌雄各半，按體重、性別隨機分成4組，每組10只，海藻多糖試驗組在禁食16h后，每次灌胃給藥最大體積（1mL/100g體重），最大濃度（0.3g/mL）海藻多糖，每8小時灌胃1次，共灌服3次，空白對照組按相同試驗條件與方法給予等容積注射用水。灌胃后的大鼠正常飼養，觀察并記錄7d內4組大鼠的生理反應、行為活動，中毒癥狀、記錄大鼠7d內體重增長情況及死亡情況。7d后將大鼠處死， 肉眼觀察大鼠主要內臟變化情況。

1.3 觀察指標

1.3.1 中樞神經系統 觀察小鼠及大鼠的（1）一般行為及反應（包括不正常叫聲，煩躁，不安，易怒，感覺過敏，少動，嗜睡或昏迷、縮邊、舔爪等）；（2）運動平衡(包括肌肉抽搐，僵硬，強迫運動，松弛，麻痹、失衡等)；（3）瞳孔及分泌物（瞳孔有否縮小或放大，流涎，流淚等）等指標。

1.3.2 呼吸系統與心血管系統 觀察小鼠及大鼠的呼吸狀態、鼻分泌、觸心前區心率快慢等指標。

1.3.3 腸胃系統 觀察小鼠及大鼠的腹部脹氣或收縮，大便形狀、狀態及色澤等指標。

1.3.4 泌尿生殖系統 觀察雌性小鼠及大鼠的陰唇、乳腺腫脹，會陰部骯臟等指標。

1.3.5 皮膚和毛 觀察小鼠及大鼠的顏色，完整性，有無充血，紫紺，蒼白，發疹，皮毛松散等指標。

1.3.6 眼 觀察小鼠及大鼠的有無眼瞼下垂，眼球突出、震顫等指標。

1.3.7 其他 觀察小鼠及大鼠的體重，每天稱量體重，注意食量變化等指標。

1.3.8 臟器系數 肉眼觀察小鼠及大鼠的主要內臟變化情況后，摘取主要臟器稱重，計算臟器系數。

1.4 統計學方法

應用SPSS19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 海藻多糖對小鼠及大鼠LD50試驗

2.1.1 小鼠LD50試驗 試驗結果：海藻多糖試驗組，灌服3次，每一次灌胃給藥最大濃度（0.8mL/20g體重）、最大濃度（1.5g/mL）的海藻多糖后，觀察小鼠除出現梳理毛發、縮邊和豎毛情況外，其他行為活動均正常，給藥1h后情況消失，活動恢復，無異常，開始進食。空白對照組給予小鼠相同劑量的注射用水，給予注射用水25min后，小鼠出現縮邊現象，其余行為活動無異常。7d內4組小鼠（40只）的生理反應（飲水、進食、大便）、行為活動均屬正常，無一死亡，也無中毒癥狀（表1），各項指標均無異常。由于7d內試驗組與空白組小鼠均未出現中毒及死亡，故該試驗無法獲得海藻多糖對小鼠的LD50。

表1 海藻多糖對小鼠7d內中毒及死亡情況（±s，n=10）

表1 海藻多糖對小鼠7d內中毒及死亡情況（±s，n=10）

組別 劑量（g/kg） 動物只數（只） 生理異常數（只） 行為異常數（只） 死亡動物數（只） 中毒動物數（只）空白對照（雌） 60 10 0 0 0 0空白對照（雄） 60 10 0 0 0 0海藻多糖（雌） 60 10 0 0 0 0海藻多糖（雄） 60 10 0 0 0 0

2.1.2 大鼠的LD50試驗 試驗結果：海藻多糖試驗組，灌服3次，每一次灌胃給藥最大濃度（1mL/100g體重）、最大濃度(3g/mL)的海藻多糖后觀察，大鼠除出現梳理毛發、縮邊和豎毛情況外（與小鼠試驗情況相同），其他行為活動均正常，給藥1h后活動恢復，無異常，開始進食。空白對照組給予大鼠相同劑量的注射用水，給予注射用水25min后，大鼠出現縮邊現象，其余行為活動無異常。7d內4組大鼠（40只）的生理反應（飲水、進食、大便）、行為活動均屬正常，無一死亡，也無中毒癥狀（表2），各項指標均無異常。由于7d內試驗組與空白組大鼠均未出現中毒及死亡，故該試驗無法獲得海藻多糖對大鼠的LD50。

表2 海藻多糖對大鼠7d內中毒及死亡情況（±s，n=10）

表2 海藻多糖對大鼠7d內中毒及死亡情況（±s，n=10）

組別 劑量（g/kg） 動物只數（只） 生理異常數（只） 行為異常數（只） 死亡動物數（只） 中毒動物數（只）空白對照（雌） 30 10 0 0 0 0空白對照（雄） 30 10 0 0 0 0海藻多糖（雌） 30 10 0 0 0 0海藻多糖（雄） 30 10 0 0 0 0

2.2 海藻多糖對小鼠及大鼠的最大耐受劑量試驗

2.2.1 小鼠最大耐受劑量試驗 試驗結果：海藻多糖試驗組，灌服3次，每次灌胃給藥最大體積（0.8mL/20g體重）、最大濃度（0.15g/mL）的海藻多糖后觀察，小鼠行為活動未見異常，給藥后1h觀察，無異常，開始進食。空白對照組小鼠給予注射用水后，活動無異常。7d內4組（試驗組、空白組）小鼠（40只）的生理反應（毛發、飲水、進食、大便）、行為活動（平衡、失調）（表3）、體重增長速度均屬正常（見表4），小鼠全部存活，無一例死亡，也無中毒癥狀發生（見表3），各項指標均無異常。試驗組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。7d后處死并進行尸體解剖后觀察， 4組（試驗組、對照組）小鼠的主要內臟器官（心、肝、脾、腎）的外觀（顏色、大小）、質地經肉眼觀察辨認均為正常，未出現病理病變情況；觀察后，摘取主要臟器稱重，計算臟器系數，4組（空白、試驗）均未發現異常（表5），試驗組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2.2 大鼠最大耐受劑量試驗 試驗結果：海藻多糖試驗組，灌服3次，每一次灌胃給藥最大體積（1mL/100g體重），最大濃度（0.3g/mL）的海藻多糖后觀察，大鼠行為活動未見異常，給藥后1h觀察，無異常，開始進食。空白對照組大鼠給予注射用水后，活動無異常。7d內（試驗組、空白組）大鼠（40只）的生理反應（毛發、飲水、進食、大便）、行為活動（平衡、失調）（見表6）、體重增長速度均屬正常（表7），大鼠全部存活，無一例死亡，也無中毒癥狀發生（表6），各項指標均無異常。試驗組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。7d后處死并進行尸體解剖后觀察，4組（試驗組、對照組）大鼠的主要內臟器官（心、肝、脾、腎）的外觀（顏色、大小）、質地經肉眼觀察辨認均為正常，未出現病理病變情況，觀察后，摘取主要臟器稱重，計算臟器系數，4組（空白、試驗）均未發現異常（表8），試驗組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 小鼠灌胃最大劑量海藻多糖后7d內中毒及死亡情況（±s，n=10）

表3 小鼠灌胃最大劑量海藻多糖后7d內中毒及死亡情況（±s，n=10）

組別 給藥體積 動物只數（只） 生理異常數（只） 行為異常數（只） 死亡動物數（只） 中毒動物數（只）空白對照（雌） 0.8mL/20g體重 10 0 0 0 0空白對照（雄） 0.8mL/20g體重 10 0 0 0 0海藻多糖（雌） 0.8mL/20g體重 10 0 0 0 0海藻多糖（雄） 0.8mL/20g體重 10 0 0 0 0

表4 小鼠灌胃最大劑量海藻多糖后體重增長情況（±s，n=10）

表4 小鼠灌胃最大劑量海藻多糖后體重增長情況（±s，n=10）

組別 性別 給藥前體重（g）給藥體積0.8mL/20g體重，給藥后體重（g）第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天空白對照 雌 18.9±0.7 20.1±0.9 21.9±1.1 22.5±1.3 23.5±1.3 24.5±1.0 25.0±1.2 26.4±1.0空白對照 雄 18.8±0.8 20.7±1.3 22.4±0.7 22.9±0.7 23.9±0.7 24.6±0.5 25.2±0.5 26.7±1.0海藻多糖 雌 18.9±0.8 20.1±0.8 21.9±1.2 22.5±1.4 23.5±1.5 24.5±1.1 25.0±1.4 26.4±1.1海藻多糖 雄 18.8±0.9 20.7±1.2 22.4±0.6 22.9±0.8 23.9±0.6 24.6±0.7 25.2±0.6 26.7±1.1

表5 小鼠灌胃最大劑量海藻多糖后動物臟器系數（±s，n=10）

表5 小鼠灌胃最大劑量海藻多糖后動物臟器系數（±s，n=10）

組別 性別 給藥體積 臟器系數（mg/g）肝臟 腎臟 脾臟 肺 心臟空白 雌 0.8mL/20g體重 7.25±1.02 1.67±0.37 0.49±0.20 1.05±0.12 0.70±0.10空白 雄 0.8mL/20g體重 7.36±2.02 1.78±0.47 0.59±0.21 1.03±0.15 0.74±0.12海藻多糖 雌 0.8mL/20g體重 7.23±1.01 1.66±0.35 0.44±0.19 1.02±0.10 0.69±0.10海藻多糖 雄 0.8mL/20g體重 7.33±2.00 1.71±0.40 0.55±0.22 1.00±0.13 0.72±0.11

表6 大鼠灌胃最大劑量海藻多糖后7d內中毒及死亡情況（±s，n=10）

表6 大鼠灌胃最大劑量海藻多糖后7d內中毒及死亡情況（±s，n=10）

組別 給藥體積 動物只數（只） 生理異常數（只） 行為異常數（只） 中毒動物數（只） 死亡動物數（只）空白對照（雌） 1mL/100g體重 10 0 0 0 0空白對照（雄） 1mL/100g體重 10 0 0 0 0海藻多糖（雌） 1mL/100g體重 10 0 0 0 0海藻多糖（雄） 1mL/100g體重 10 0 0 0 0

表7 大鼠灌胃最大耐受量海藻多糖后體重增長情況（±s，n=10，g）

表7 大鼠灌胃最大耐受量海藻多糖后體重增長情況（±s，n=10，g）

組別 性別 給藥前體重給藥后體重第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天空白對照 雌 190.5±13.6 179.4±15.0 187.9±12.8 194.8±13.3 198.3±12.6 204.9±12.9 209.8±12.6 213.6±11.0空白對照 雄 196.5±18.0 188.3±17.2 197.8±18.7 203.4±18.9 209.5±19.3 216.6±18.3 221.6±18.5 229.7±11.9海藻多糖 雌 190.6±13.6 178.9±15.0 188.9±12.8 195.8±13.3 198.3±12.7 205.0±12.9 209.8±12.7 213.4±11.1海藻多糖 雄 196.4±18.0 188.5±17.3 197.8±18.6 204.4±18.9 209.5±19.5 216.6±18.5 221.6±18.8 229.8±12.0

2.2.3 試驗觀察指標 試驗結果：試驗組（小鼠、大鼠），各項指標觀察均未出現異常；空白對照組（小鼠、大鼠），各項指標觀察均未出現異常(表9）；兩組比較無差異，空白組、試驗組的小鼠及大鼠均全部存活，各組全部無1例死亡。試驗組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表8 大鼠灌胃最大耐受量海藻多糖后動物臟器系數（±s，n=10）

表8 大鼠灌胃最大耐受量海藻多糖后動物臟器系數（±s，n=10）

組別 性別 給藥體積 臟器系數（mg/g）肝臟 腎臟 脾臟 肺 心臟空白 雌 1mL/100g體重 7.13±0.79 1.79±0.25 0.55±0.10 1.20±0.20 0.95±0.10空白 雄 1mL/100g體重 10.53±1.68 2.78±0.39 0.78±0.16 1.47±0.27 0.74±0.12海藻多糖 雌 1mL/100g體重 7.10±0.69 1.77±0.21 0.51±0.11 1.18±0.22 1.35±0.20海藻多糖 雄 1mL/100g體重 10.49±1.68 2.72±0.31 0.76±0.12 1.40±0.25 1.30±0.19

表9 小鼠及大鼠試驗觀察指標

3 討論

3.1 試驗動物選擇

急性毒性試驗研究，運用到了毒理學的相關科學知識，而毒理學是一門專門的科學，是研究所有外源因素（如化學、物理和生物因素）對生物系統（living systems）和生態系統（ecosystem）的損害作用或有害效應（adverse/harmful effects）與機制，以及中毒的預防、診斷和救治的科學[7]，本試驗參考并遵照國家藥品監督管理局頒布的《中藥新藥研究的技術要求》中的《中藥新藥藥理毒理研究的技術要求》進行。在試驗的設計上，試驗依據隨機、對照、重復的原則，受試藥物海藻多糖提取純化制備工藝穩定，收率及含量重復性良好，符合動物學試驗用藥的規定；在試驗動物的選用上依據毒性試驗動物選取原則，即種屬間存在差異、雌雄各半、試驗動物不能太少，故選用小鼠和大鼠為試驗觀察動物，從而使得該試驗在試驗在設計上更加合理，試驗結果更加科學、嚴謹，進而達到了急性毒性研究的目的[8]。

3.2 評價方式及初步論斷

LD50[9]是評價物質急性毒性大小最重要的參數，使用半數致死量能夠有效評價出物質的急性毒性，本試驗在進行LD50試驗考察毒性時，由于試驗考察動物（小鼠、大鼠）在7d內均未發生中毒及死亡，故無法獲得LD50數據，所以只能采用另一種評價方式-最大耐受量試驗對毒性加以考察，此也從一方面初步證實了海藻多糖毒性較小，屬于低毒或無毒物質。

最大耐受量[10-11]既屬于毒理學研究范疇同樣也是安全藥理學研究的內容之一，安全藥理學研究范疇是探討在治療或治療劑量以上劑量范圍時，對潛在的、不期望出現的，對生理機能的不良作用。其研究目的在于排除不安全藥物進入臨床， 為臨床安全用藥提供向導，并通過最大耐受量估算新藥的安全范圍，為臨床確定治療劑量提供依據，是新藥必需具備的要素，即安全、有效。另外，最大耐受量強調的是不引起受試動物死亡的最高劑量，即超過該劑量，受試動物就會出現死亡，因此，理論上講，最大耐受量對于一個藥物來講是一個相對固定的值，該數值本身對于闡明某個藥物的急性毒性情況就是一個重要的參考信息。故本試驗在進行LD50試驗未檢得出有效數據的前提下，通過最大耐受量試驗對毒性加以考察，該試驗在對小鼠進行考察時，試驗數據表明，通過一次灌胃給藥（最大體積、最大濃度）海藻多糖，小鼠沒有出現死亡及中毒癥狀，說明其最大耐受劑量應為6.0g/kg，相當于臨床擬推薦劑量1.2g/（60kg·d）的300倍；同樣在對大鼠進行考察時，試驗數據也表明，通過一次灌胃給藥（最大體積、最大濃度）海藻多糖，大鼠也沒有死亡及中毒癥狀，說明其最大耐受量應為3.0g/kg，相當于臨床擬推薦劑量1.2g/（60kg·d）的150倍，試驗后對小鼠及大鼠處死，并進行尸解，通過肉眼觀察，4組（試驗組、空白組）小鼠及大鼠各主要臟器器官均未發現肉眼可見的病理病變，觀察后，摘取小鼠及大鼠各主要臟器器官稱重，計算臟器系數，臟器系數又稱臟體比，是試驗動物某臟器的重量與其體重之比值。正常時各臟器與體重的比值比較恒定。動物染毒后，受損臟器重量可以發生改變，故臟器系數也隨之而改變。臟器系數增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器系數減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。一般選用肝、腎、脾、肺、心等主要臟器器官，臟器系數是毒理試驗中常用的指標，本試驗中通過選取并計算4組（試驗組、空白組）小鼠及大鼠各主要臟器器官的臟器系數，對比后發現，數值均在正常范圍內，未出現增大或減小的異常波動，揭示海藻多糖毒性較低或基本無毒。據此并結合LD50試驗是驗證了海藻多糖毒性較小，屬于低毒或無毒物質這一論斷。

當然這只是初步論斷，雖然急性毒性試驗結果表明，海藻多糖對試驗動物的中樞神經系統、心血管系統及呼吸系統無明顯毒性影響，或者說由于其毒性較小，屬于低毒或無毒物質，才使其對試驗動物的中樞神經系統、心血管系統及呼吸系統是不會造成影響，但在日常使用中究竟會不會產生影響，還需要通過一般藥理學試驗其他試驗項目內容研究加以試驗及內容補充，這是因為急性毒性試驗一般被包含在一般藥理學研究中，所以該試驗只能算是完成了一般藥理學毒性研究的一部分，試驗當下研究題目下完整但就試驗整體而言還不算完整，缺失的毒性試驗研究部分需要通過一般藥理學試驗中的其他試驗如對試驗動物的中樞神經系統的影響、試驗動物的心血管系統及呼吸系統的影響等試驗加以補充與驗證，從而保證試驗論斷的科學性與嚴謹性，這是其一。其二長期服用海藻多糖會對試驗動物主要器官（心、肝、腎、脾）產生何種影響，能否產生毒性及蓄積，停藥后會否產生后遺癥，會否引起病理病變，長期大劑量服用時應注意哪些器官及功能的變化，這些需要進行長期一般毒理學試驗加以探索與論證。其三，雖然還需進行相關試驗，但該項試驗確定了動物的最大耐受量值，其為后續試驗的安全劑量考察范圍值確定，提供了重要的理論參考。

海藻多糖就目前的試驗結果而言是一種極為安全的天然活性多糖物質[12]，將其作為藥物使用是安全的，況且我國海藻資源十分豐富[13]，生物活性物質的種類也很多，有待進一步開發。尤其是近年來越來越多的活性多糖應用與臨床，海藻多糖在未來臨床應用上作用是非常肯定的[14]，但需經進一步的開發與試驗研究，才可以廣泛地用到臨床中，同時海藻資源在醫藥、食品、飼料、化工和化妝品等領域同樣具有廣闊的開發應用前景，以廉價海藻多糖為物質基礎可生產出大批量具有重要價值的產品。海藻多糖類研究有望成為今后生命科學領域的熱點之一[15]。