奶牛瘤胃微生物研究進展和趨勢

吳家勁 朱森林 周密 孫會增

（1. 浙江大學動物科學學院奶業科學研究所，杭州 310058；2. 加拿大阿爾伯塔大學農業食品營養科學系，埃德蒙頓，加拿大 T6G 2P5）

奶及奶制品是人類最重要的食用蛋白質來源之一。奶牛作為奶及奶制品的供應源，起著關鍵作用。雖然當前奶牛的產奶性能已經達到了較高水平，如美國奶牛的年平均產奶量超過了10 t［1］，但隨著世界人口的持續增長以及人均牛奶需求量的逐漸增加，如何進一步提高奶牛生產效率和環境可持續性成為了當前緊迫的任務。目前，該方面的研究已經從關注傳統的泌乳調控的外部要素（如改變日糧的營養成分等）逐漸轉變為揭示泌乳調節的生物學過程［2］。奶牛的瘤胃微生物包括細菌、古菌、真菌和原蟲4大類，它們負責降解和發酵不同類型的飼料，從而為宿主的生長、繁殖、維持和泌乳提供大量營養物質，這就為揭示相關的生物學過程提供了巨大的潛力［3］。瘤胃中的微生物通過發酵合成揮發性脂肪酸（Volatile fatty acid，VFA），微生物蛋白（Microbial crude protein，MCP）和維生素等養分與宿主建立聯系，協助宿主完成多種生理活動［4］，這為研究和調控奶牛的泌乳生物學過程提供了幫助，有利于實現更加高效和可持續的奶業。

1990年前，奶牛瘤胃微生物的研究主要依靠基于培養的方法，但由于大多數瘤胃微生物是不可培養的，因此得到的信息非常有限［5］。之后出現了一系列新技術，并逐漸應用于奶牛瘤胃微生物領域。以“奶牛”和“瘤胃微生物”的英文翻譯為關鍵詞在Web of Science數據庫中進行檢索，結果顯示從1990-2019年，共有2 052篇相關SCI文章發表，2013年以后文章數量增長較快（圖1）。使用一個詞云來說明這2 052篇論文摘要中出現的高頻詞，其中最常見的有“甲烷”、“瘤胃”、“發酵”、“MCP”、“VFA”、“奶產量”、“16S”和“宏基因組學”（圖1）。這表明在奶牛瘤胃微生物領域的已發表研究中，與效率和生產有關的參數受到了更多的關注。此外，近年來瘤胃微生物對犢牛健康和發育的影響也開始受到了重視［6-7］。越來越多的研究強調了二代測序（Nest generation sequence，NGS）技術在檢測和分析微生物中的重要性，如擴增子測序、宏基因組學、宏轉錄組學和宏蛋白組等。16S rRNA基因等擴增子測序、宏基因組學和宏轉錄組學分別用于識別操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU）/擴增子序列變異體（Amplicon sequence variants，ASV）、預測功能信息和活性微生物/代謝通路（圖1）。這些基于NGS的研究需要扎實的綜合知識，包括生物信息學、分析化學、生物學等。最近一項基于283個牛瘤胃微生物宏基因組二、三代混合測序的研究將宏基因組數據比對率從15%提高至50%-70%，同時也提供了宏基因組分箱、下游分析的全套流程和方法標準［8］。即便NGS高通量分析方法已經被廣泛接受并形成標準流程，但在應用過程中的技術性操作和數據處理分析產生的變異也必須最小化［9］。在NGS分析流程中，如樣品DNA/RNA的提取［10］、分類學數據庫的比對［11］、數據歸一化［12］，任何不當的處理都將導致微生物檢測的結果出現顯著偏差和錯誤。

圖1 奶牛瘤胃微生物領域論文發表、研究熱點和研究方法

奶牛瘤胃微生物研究正處于快速發展階段，但同時也面臨著巨大挑戰。瘤胃微生物可以在多大程度上幫助人們揭示奶牛泌乳的基本生物學機制仍然是一個問題。為了更好理解瘤胃微生物與奶牛生長發育和重要表型的關系，以期從瘤胃微生物調控策略角度提高奶牛生產效率和環境可持續性，本文系統綜述了瘤胃微生物在產奶效率、甲烷排放和瘤胃發育方面的研究進展，詳細歸納了瘤胃微生物與奶牛主要生產性狀關系，同時指出了奶牛瘤胃微生物未來的研究趨勢。

1 瘤胃微生物與奶牛產奶效率

目前，全球奶牛養殖業面臨的重要挑戰之一是如何提高動物對飼料能量的利用效率［13］。產奶效率是指產奶動物研究上所使用的飼料效率的概念，反映了牧場盈利能力和對環境的影響［14］。產奶效率的不同通常歸因于先進的遺傳選育、飼養和管理策略［15-16］。但是，產奶效率是一個復雜的性狀，除了遺傳因素外，奶牛個體之間的差異還受許多因素的影響［17］。有證據表明，瘤胃微生物的組成、菌群內部以及與宿主的相互作用與乳成分和飼料效率有關［18-19］。作為瘤胃中微生物群發酵的最終產物，VFA可以提供奶牛70%以上的能量需要［19］，MCP可以提供60%的小腸可吸收非氨態氮［20］。VFA和MCP給奶牛提供了大量的養分，并顯著影響營養狀況，最終導致飼料效率變化。加拿大Leluo Guan教授實驗室發現肉牛的飼料效率與瘤胃微生態［21］、細菌菌群［22-23］和甲烷菌群有關［24］，且最新的試驗表明某些與飼料效率相關的瘤胃微生物特征可遺傳［25］。其他研究人員也發現了相似的結果［26-27］。相比之下，奶牛在一個泌乳周期不同的生理階段（如泌乳早期、泌乳中期、泌乳后期、干奶期和圍產期），能量需求存在較大波動，這為類似的研究帶來了更多挑戰。

Jami等［4］對15頭奶牛的泌乳性能參數與瘤胃細菌群落進行相關性分析發現，產奶量和乳成分與各種瘤胃細菌的豐度密切相關，如Adlercreutzia與產奶量呈正相關（R = 0.57，P= 0.027），Firmicutes與Bacteroidetes的比率和乳脂產量之間也存在很強的相關性（R = 0.72，P= 0.002）。但是，這項研究并未考慮泌乳階段的影響，因此，他們實驗室使用454焦磷酸測序進一步表征了14頭荷斯坦奶牛在前兩個泌乳周期的早期、中期和后期的細菌群落組成［28］。結果表明，即使在相同的日糧條件下，瘤胃微生物菌群在不同泌乳期和年齡中也是動態的，低效率奶牛的Anaerovibrio和Butyrivibrio的豐度較高，而Coprococcus的豐度較低，這表明瘤胃微生物菌群在影響奶牛產奶效率方面可能起著至關重要的作用。本課題組最近對334頭奶牛瘤胃微生物的16S rRNA基因進行測序發現，瘤胃菌群與產奶能力之間存在顯著相關，其中核心微生物群對關聯的貢獻為 52.9%［29］。Shabat等［30］比較了 40頭泌乳中期的高效率奶牛和38頭低效率奶牛的瘤胃細菌和古菌發現，高飼料效率奶牛有著較低的瘤胃微生物組基因含量和OTU豐度，他們還提出了Megasphaera elsdenii和Coprococcus catus是產奶效率的關鍵決定因素。Xue等［31］比較了20頭低產奶量、低乳蛋白產量（LL）奶牛和20頭高產奶量、高乳蛋白含量（HH）奶牛的瘤胃細菌菌群發現，HH組奶牛瘤胃的Sharpea屬相對豐度顯著高于LL組，而Succinivibrio顯著低于LL組。這些結果表明，瘤胃中的少數微生物種類可能會在一定程度上影響微生物菌群的結構和功能，最終改變宿主的生產效率。因此，對瘤胃微生物作用機制的理解可以潛在地應用于實現高效和環保的畜牧業。在圍產期，適應日糧的變化對瘤胃微生物來說是一個很大的挑戰［32］。Lima等［33］使用MiSeq對115頭高產奶牛產前和產后瘤胃微生物的16S rRNA和18S rRNA進行了測序，結果顯示，與產后奶牛相比，產前真菌的豐富度較高，而纖毛蟲的豐富度較低，產前和產后瘤胃微生物菌群的變化曲線可用于準確預測宿主的生產性狀。Jewell等［28］對奶牛連續3個泌乳周期進行研究發現，較高豐度的Christensenellaceae家族與產奶效率也呈負相關。Derakhshani等［34］研究發現，在產前，當奶牛的自由干物質采食量減少時，瘤胃微生物的個體間差異大大降低，在產后，當自由干物質采食量增加時，蛋白降解菌、淀粉分解菌和乳酸產生菌的豐富度較高，這表明瘤胃微生物能夠從高濃度碳水化合物的產后泌乳日糧中獲取能量。Indugu等［35］使用16S rRNA基因擴增子序列比較了泌乳中期的47頭高產奶牛和38頭低產奶牛的瘤胃細菌組成，結果發現在高產奶牛中，Succinivibrionaceae豐度較高，Prevotella、S24-7和Succinivibrionaceae與產奶量呈正相關，但是該研究并沒有排除日糧因素對產奶量的影響。為了研究其中的作用機制，而不僅僅是瘤胃微生物群與產奶效率之間的相關性，Weimer等［14］把高低效率奶牛的瘤胃內容物幾乎完全互換，結果表明瘤胃細菌群落對產奶效率有明顯的貢獻，并提示移植和重塑整個瘤胃微生物菌群可以改變宿主表型。通過評估低、中、高產奶量和干奶期的荷斯坦奶牛的瘤胃細菌、古菌和真菌對甲烷排放量和生產性能的影響，Cunha等［36］的研究發現，瘤胃中高豐度 的Christensenel-laceae，Mogibacteriaceae，S24-7，Butyrivibrio，Shwartzia，Treponema和Methanosphaera可能會減少甲烷排放并提高產奶量。

與產奶效率相關的瘤胃微生物的研究工作主要是在近幾年完成的，這些研究大大拓寬了我們對瘤胃微生物與宿主生產性能之間的相互作用的理解［37］。根據已有的研究結果，對瘤胃微生物進行調控的可行性越來越大，如直接給奶牛口服活性微生物對提高產奶量有很好的效果［38］。然而，目前對瘤胃微生物菌群的認知還非常有限。對瘤胃中特定的微生物和微生物間復雜的相互作用的進一步探索需要更先進的技術，能在種或菌株水平來準確鑒定微生物［39］。與目前依賴相關性和推測分析的研究相比，建立一個更可靠的模型來評估瘤胃微生物菌群對產奶量的影響，并預測瘤胃微生物對日糧調控的反應，更具挑戰性［40］。在未來，將微生物這個因素納入“遺傳-環境-瘤胃-微生物菌群”的相互作用模型中，來加深對奶牛泌乳機制和調控的了解是件值得期待的事情。在微生物分析中除了微生物多樣性和預測功能外，關注直接反映微生物代謝活性的下游代謝物，對了解瘤胃發生的生物學機制也具有重要作用［41-42］。利用有效途徑改善瘤胃功能只是時間問題，但選擇調控方法時，必須考慮瘤胃微生物群代謝引起的環境問題，特別是來自甲烷代謝的環境問題［43］。

2 瘤胃古菌的甲烷排放與減排的研究進展

家畜胃腸道甲烷排放約占全球甲烷排放量的17%［44］。奶牛排放的甲烷占其能量損失的5.3%-6.1%［45-46］，甲烷的增溫潛力是二氧化碳的 25 倍［47］，減少胃腸道甲烷的排放對經濟和環境都有積極的影響。

瘤胃中的古菌是主要產甲烷菌。近20年來，對瘤胃古菌的研究蓬勃發展，其主要集中于瘤胃古菌群落的組成及開發調控甲烷菌的方法的研究。一般來說，泌乳的反芻動物每克瘤胃內容物中含有107-108個古菌。甲烷菌群通常由3個主要的系統發育群組成，包括Methanobrevibacter、Methanomicrobium和Methanomassiliicoccales［48］。

降低動物胃腸道甲烷排放的研究主要集中在降低古菌總數上，如添加食用油和脂肪酸［49-50］，甲烷菌的免疫抑制［51］、清除原蟲［52-54］和調整日糧配方［55］等措施。然而，無論古菌總數是否受到影響，這些方法都沒有實現長期有效地減少甲烷排放。于是有人提出了一個問題：古菌總數是否重要。事實上，后來的研究已經證明，古細總數量與宿主甲烷排放量無關［24，56-57］。相反，古菌群落的結構被認為與宿主甲烷排放有關。與Methanobrevibacter gottschalkii相關的古菌系統發育群和荷斯坦奶牛甲烷排放量呈正相關［58］。Danielsson 等［59］根據 King 等［51］和Danielsson等［56］的研究，通過將系統發育群劃分為SGMT組（Methanobrevibacter smithii、Methanobrevibacter gottschalkii、Methanobrevibacter millerae和Methanobrevibacter thaueri）和RO組（Methanobrevibacter ruminantium和Methanobrevibacter olleyae）來研究瘤胃的古菌群落，部分解釋了奶牛胃腸道甲烷排放的變化。RO組相對豐度越高，奶牛甲烷排放量越低［59］。一項基于超過1 000頭奶牛基因型和16S rRNA和18S rRNA測序的研究，發現奶牛具有的核心微生物群落對決定甲烷排放有顯著作用［60］。因此，減少動物胃腸道甲烷排放的有效方法可能依賴個別古菌而非整個古菌群落。

不同的飲食結構可以改變宿主瘤胃古菌群落的組成，但在之前的研究中，飲食干預并沒有實現長期減少甲烷排放［61-62］。2014年有學者開發的3-硝基丙醇（3-NOP），是一種結構上類似于甲基輔酶M的化合物，在對多個奶牛研究中證明其可以有效地減少胃腸道甲烷的排放［63-64］。這種化合物針是對甲烷生成的最后一個步驟來抑制瘤胃甲烷的產生［65］。有研究證明海藻也可以減少胃腸道甲烷的排放。用海藻喂養肉牛時，農場內的甲烷排放量大大降低（Kiney等，未發表）。在最近的一項研究中，用風干的棕色海藻飼喂公羊，古菌數量減少了50%以上［66］。之前的任何研究均未實現如此顯著的古菌種群減少，這需要進一步研究飼喂海藻減少動物胃腸道甲烷排放的機制。

改變宿主幼年時的瘤胃古菌群落的組成可能是另一種甲烷減排的方法。斷奶前的犢牛胃腸道幾乎不產生甲烷，但甲烷菌群在犢牛幼年時期就已發育。Zhou等［67］對3周齡的犢牛胃腸道的微生物進行了研究發現，盡管個體間的菌群相對豐度和組成差異很大，但在提供固體飼料之前，甲烷菌群已形成。正如Yá?ez-Ruiz［68］等提出的，在反芻動物的幼年時期，特別是在瘤胃微生物群完全建立之前，是“預先規劃”瘤胃微生物區系的理想時間窗口。因此，有必要進一步研究如何應用早期干預方法建立一個既能產生較少甲烷又能有效處理氫氣的古菌群落。

很多研究都是基于基因組DNA和RNA的分析方法開展的，在對微生物DNA樣品進行檢測的研究中，無論是采用傳統的分析方法（如克隆文庫、PCR-DGGE、T-RFLP），還是高通量測序方法（如擴增子測序、宏基因組），人們一直認為與Methanobrevibacter相關的古菌是瘤胃中產甲烷的主要的微生物。然而，一項基于宏轉錄組分析活性微生物群的研究發現，相對豐度最高的古菌轉錄本與Methanomassillicoccales有關［69］。這一結果提示需要重新考慮瘤胃古菌群落研究方法的重要性以及不同方法在多大程度上反映出“真實的微生物群落”。瘤胃古菌群落研究的局限性還表現在所參考數據庫的選擇和分類學方法的選擇上。當使用基于16S rRNA基因序列的方法和宏基因組時，從DNA樣本中發現了不同的古菌組成。不同數據庫（SILVA、RDP、Greengenes、NCBI和OTT）中包含的不同參考序列也導致相同樣本的不同分類歸屬［11］。因此，對瘤胃古菌群落的研究迫切需要規范的工作流程。但新的分析和測序方法的出現將有助于更好地了解包括古菌在內的瘤胃微生物的組成及功能。

3 瘤胃微生物在瘤胃發育中的作用

3.1 組學和瘤胃發育早期微生物

近年來，隨著NGS的廣泛應用，對反芻動物建立反芻行為前的瘤胃微生物研究成為了熱點。在這些NGS方法中，最常用的方法是16S rRNA基因的擴增子測序。有研究利用擴增子測序發現瘤胃微生物定植始于犢牛出生的第1天［70］。瘤胃細菌的復雜性（多樣性）隨著犢牛年齡的增長而增加，同時個體間的異質性減少［70］。Rey等［71］對同一組犢牛從出生到第83天進行研究，以探索瘤胃微生物定植的時間動態變化，盡管他們沒有對犢牛出生第1天的瘤胃細菌群落進行分析，但成功地展示了不同分類水平下細菌群落的時間變化，特別是這項研究清楚地表明，優勢菌群的豐度隨犢牛年齡及其采食量的變化而變化。例如，隨著固體飼料的引入，犢牛瘤胃中相對豐度最高的細菌屬之一Prevotella的豐度顯著增加［70，72-73］。Jami等［70］和 Rey 等［71］使用瘤胃液來研究瘤胃細菌群落，通過比較瘤胃內容物與瘤胃黏膜表面附著細菌的含量，發現兩個微生物群落之間存在顯著差異［73］，因此在研究幼齡反芻動物的瘤胃微生物組成時，這兩個微生物群都應該納入考慮。

擴增子測序主要是產生關于分類組成及其相對豐度的數據，值得一提的是，利用一些生物信息學分析方法，如PICRUSt［74］、Tax4Fun［75］、PICRUSt2［76］等可以根據擴增子測序數據預測微生物功能。與擴增子測序相比，宏基因組測序允許通過對微生物的全基因組測序來探索菌群分類和功能組成。用宏基因組評估動物建立反芻行為前的微生物區系的報道較少［72，77］。但這些研究已經報道了在建立反芻行為前，甚至在引入固體食物之前，瘤胃中就存在水解復雜碳水化合物中糖苷鍵的糖苷水解酶。擴增子測序顯示，在建立反芻行為前，瘤胃中就存在類似成年反芻動物的菌群，而宏基因組測序顯示，類似成年反芻動物的菌群包含復雜的碳水化合物發酵所需的基因。盡管基因的存在并不一定意味著它們有活性，但基于宏基因組測序的方法為探索反芻動物建立反芻行為前的瘤胃微生物提供了在功能層面的線索。因此，在未來，使用宏轉錄組的測序方法將有助于更好地了解反芻動物建立反芻行為前的瘤胃微生物群的活性/功能。這對于預測早期微生物在瘤胃發育過程中的作用是至關重要的。

3.2 影響早期發育瘤胃微生物組成的因素

對早期發育瘤胃微生物的研究提示了很多可能影響微生物區系的因素，這些因素主要分為生物學因素（年齡、飲食、斷奶方法/年齡、個性差異）和技術因素（取樣方法/類型、測序方法、16S靶區、數據庫/質量控制/生物信息學工具、環境污染）。探索瘤胃微生物定植過程的研究［70-71，77-78］清楚地證明了瘤胃微生物組的年齡依賴性變化，還需要注意的是，這些研究中的年齡依賴性變化總是與飲食變化相結合。在Li等［72］的研究中，犢牛出生后只飼喂代乳品，并在第2周和第6周采集瘤胃液進行16S rRNA和全基因組鳥槍法測序。因此，觀察到的微生物群落的組成和功能的變化僅代表瘤胃微生物的年齡依賴性變化。

Abecia等［79-80］使用雙胞胎羔羊進行兩種飲食干預，這樣可以使遺傳變異的影響最小化，從而充分反映出斷奶前飲食對瘤胃微生物群的影響。這些研究表明，早期飲食干預的變化（代乳品與哺乳）影響瘤胃微生物群［79-80］及其定植過程［81］。因此，即使在斷奶后，早期喂養也是調節瘤胃微生物定植過程和微生物組成的重要因素之一。然而，這種飼養方式是如何影響與早期瘤胃發育過程相關的瘤胃微生物群功能的問題仍未得到解答。

影響早期瘤胃微生物的生物學因素可以真實地解釋瘤胃微生物定植過程，但技術因素可能會使結果出現偏差。特別是，在擴增子測序中使用16S rRNA基因高變區和引物會引入假象［82-83］。Jovel等［79］清楚地展示了基于NGS技術層面影響腸道微生物數據解釋的因素。他們在宏基因組和擴增子測序中使用了模擬（人工）菌群，并比較了數據處理和分類的可用方法以評估最適合的方法。雖然擴增子測序存在很多問題，但宏基因組測序因為缺乏參考基因組而受到影響。特別是，他們觀察到，在沒有生物參考基因組的情況下，序列會被分配到最接近的參考基因組。此外，環境污染也是影響群落組成的重要因素。因此，樣品制備過程使用陰性對照可以避免污染造成的偏差。

3.3 瘤胃微生物在瘤胃早期發育中的作用

目前很多研究關注反芻動物斷奶過渡期瘤胃的生理（瘤胃乳頭長度、瘤胃大小）、代謝（發酵能力）和轉錄（轉錄組、microRNA組）的變化。雖然固體飼料的引入有助于瘤胃的生理和代謝發育，但瘤胃發育背后的分子機制是個體發育控制的［85］。然而，有研究試圖揭示早期瘤胃發育背后的分子機制［86-89］。Connor及其同事還提出，潛在的分子標記物（轉化生長因子-β1和雌激素相關受體-α）與瘤胃發育過程相關［87］。此外，瘤胃細菌與microRNAs表達之間的關聯性表明，早期微生物群可能參與瘤胃早期發育過程中的轉錄調控［88］。近期Malmuthuge等［90］通過整合犢牛在出生30 min，第1周、第3周和第6周的瘤胃微生物（組織和內容物）宏基因組和宿主瘤胃組織轉錄組數據發現，早期微生物群可能通過鋅的吸收影響瘤胃發育，這種相互作用可能通過miRNA進行調節。

人們對腸道微生物菌群在哺乳動物胃腸道發育中的作用已有較為充分的研究［86］，但對瘤胃微生物群（一種研究時間最長和最多的宿主相關微生物群）對個體發育的調控機制的認識依然非常有限。Malmuthuge等［92］研究了瘤胃微生物組、轉錄組和microRNA組之間的相互作用，并利用一個綜合的網絡分析來揭示潛在的微生物驅動瘤胃發育的分子機制。這項研究進一步表明，組織發育和代謝相關基因和microRNAs（26.3%的mRNAs和46.4%的microRNAs）與微生物代謝產物濃度相關，這意味著并非所有與瘤胃發育相關的機制都是個體發育調節的。然而，這些機制仍然只是基于關聯分析，有待進一步通過設計試驗和功能驗證來證實。利用免疫染色在蛋白質水平上確認瘤胃微生物驅動瘤胃發育的變化，可能為驗證基于關聯分析的預測和鑒定微生物驅動的瘤胃發育提供更多的機會。

4 小結與展望

瘤胃微生物種類繁多、功能強大，其參與或影響宿主生理功能及表型的特征和機制逐漸被認識。在奶牛研究中，有關瘤胃微生物如何影響產奶性能、甲烷排放和瘤胃發育的研究被相繼報道，一些關鍵的微生物種類和代謝通路也被揭示。為了更加系統便捷的展示相關結果，我們整理了瘤胃微生物與奶牛主要生產性狀的關系（表1），其中涵蓋了具體性狀、各項研究中的技術方法和主要發現。這些研究

結果有助于我們理解瘤胃自身發育、調控甲烷產生以及提高牛奶產量和效率，對將來通過微生物調控策略實現奶業高效可持續發展也提出新的見解。

表1 瘤胃微生物與奶牛主要生產性狀的關系

同時我們也應該認識到，奶牛瘤胃微生物的研究還遠遠不夠。例如，對于瘤胃微生物成員的解析還需要大量的工作，盡管目前基于培養的方法，對瘤胃細菌和古菌的研究取得了一些進展［93］，但更多的細菌和古菌仍需要建立培養方法在實驗室進行研究。近期基于283個牛瘤胃微生物宏基因組二、三代混合測序的研究大幅度提高了宏基因組數據比對率［8］，但據估計至少還有1 000種以上瘤胃微生物有待測序和組裝，尤其是對瘤胃中真核生物（如厭氧真菌、原蟲）和病毒組的測序仍然存在巨大的技術挑戰。長讀長的三代測序和單細胞微生物測序將有助于探索新型功能基因和物種豐度極小的未被培養的瘤胃微生物。此外，在功能層面，功能基因的表達和編碼蛋白的活性研究還需要借助宏轉錄組和宏蛋白組開展大量工作。目前對瘤胃微生物代謝過程中代謝豐富度的探究方法依然不足，因此對瘤胃微生物代謝過程的研究可能只是盲人摸象，有學者指出通過使用功能組（Functional group）整合瘤胃微生物物種分類（因為不同的物種分類的微生物在功能上也可能相同，同種物種分類的微生物功能也存在差異）來解決由于水平基因轉移事件以及功能冗余而造成的分類混亂，進而更好地解析瘤胃中的具體代謝途徑［94］。奶牛瘤胃微生物功能的研究還需要逐漸從描述性向機制性轉變，將來微生物組和其他組學及宿主功能基因組的聯合分析將有助于識別和構建瘤胃微生物的功能性和生態性網絡，進而通過網絡調控減少甲烷排放和提高泌乳效率。