丁酸調控幼齡反芻動物瘤胃上皮發育研究進展

王璐 劉理想 孫大明 劉軍花

（1. 國家動物消化道營養國際聯合研究中心 江蘇省消化道營養與動物健康重點實驗室 南京農業大學消化道微生物研究室，南京 210095；2. 動物科學類國家級實驗教學示范中心 南京農業大學，南京 210095）

1 幼齡反芻動物瘤胃上皮的生長發育

反芻動物的胃分為4部分，分別為瘤胃、網胃、瓣胃和皺胃。瘤胃是反芻動物主要消化吸收代謝的場所。瘤胃微生物發酵產生的揮發性脂肪酸（VFA）被瘤胃上皮吸收代謝，可為機體提供70%以上的能量需要。同時，瘤胃上皮還起著重要的免疫和屏障作用，其形態及功能的完善對保證反芻動物健康具有重要意義。因此，利用營養調控手段促進幼齡反芻動物瘤胃上皮發育完善是保證動物健康及提高生產效率的關鍵［1］。

1.1 瘤胃上皮的形態結構及功能

瘤胃壁由內到外由黏膜層（瘤胃上皮）、肌層和漿膜層3層組成。黏膜層呈棕黃色或棕黑色，表面分布著大量向瘤胃腔內突出的上皮乳頭。瘤胃乳頭的生長增加了瘤胃上皮的吸收表面積。因此，了解瘤胃乳頭生長的機理，對于制定提高反芻動物生產性能的策略具有重要意義［2］。眾所周知，當飼料來源由母乳過渡為粗飼料或精料開食料時，瘤胃乳頭快速發育［3］。瘤胃微生物發酵碳水化合物的產物VFA可誘導瘤胃乳頭生長，丁酸是瘤胃乳頭生長最有效的激活劑［4］。不同成年反芻動物的瘤胃乳頭長度存在較大差異，牛約1 cm，羊約0.5 cm［2］。瘤胃乳頭可增加瘤胃上皮與底物的接觸面積，促進機體對營養物質的吸收和轉運。

瘤胃上皮由角質層、顆粒層、棘突層和基底層4層組成［5］，每一層都有其獨特的結構和生物學功能。角質層細胞內含有大量的角蛋白，是瘤胃內環境與外環境的重要物理性屏障［6］。顆粒層細胞呈扁平狀，細胞間由橋粒連接，是上皮的主要滲透屏障，可有效阻止外來物質擴散進入上皮底層。棘突層細胞呈橢圓形，有鋸齒狀邊緣。基底層細胞是柱狀細胞牢固地附著在基底膜上。棘突層細胞和基底層細胞含有功能完善的線粒體等其他細胞器，這些細胞成分有助于瘤胃上皮代謝，主要是把部分VFA轉化成酮體［7］。同時，基底層細胞還參與瘤胃上皮細胞的更新與修補。

1.2 瘤胃上皮的組織形態發育

與成年反芻動物其他功能器官占空腹體重的百分比下降相反，在斷奶過程中，瘤胃占胃腸道總容積從30%上升到70%［8］。由于未斷奶反芻動物需要消化和吸收母乳中的營養物質，因此小腸在此過程中起主要作用［9］。幼齡反芻動物的瘤胃上皮生理和代謝發育都不完全，瘤胃上皮未表現出高度角質化特征［10］。幼齡反芻動物攝入固體飼料后，瘤胃經過物理和化學的作用逐漸發育成熟。早期的研究表明，瘤胃中飼料的物理刺激可以顯著增加瘤胃的重量和肌肉組織發育［11］。因此，為了促進瘤胃上皮的正常發育，必須建立一個可行的瘤胃發酵過程，這表明在瘤胃腔內存在VFA以促進正常乳頭的發育［11］。幼齡反芻動物在生命的最初幾個月如僅靠母乳飼喂，則使瘤胃重量、瘤胃容量、乳頭生長、角質化程度、色素沉積和肌肉組織不能很好發育［8，10，12］，這是由于通過食管溝的反射性閉合將母乳直接分流至皺胃［13］，從而阻止了用于瘤胃發酵的底物進入瘤胃。有研究表明，當液態奶直接灌入瘤胃時可產生VFA并刺激瘤胃乳頭生長［12］。同時，相關研究也表明，口腔灌注一定濃度的VFA可導致羔羊瘤胃乳頭長度增加［14］。研究表明開食料中增加精料的量并沒有導致瘤胃肌層的改變，但確實增加了新生犢牛和羔羊的乳頭密度和乳頭長度［3］。丁酸和丙酸代謝可能引起瘤胃上皮細胞血流量的增加，也可直接影響瘤胃上皮生長發育相關基因表達［15］。

1.3 瘤胃上皮功能的發育

飼料中的碳水化合物經過前段消化道發酵產生的VFA可為反芻動物提供70%以上的能量需要。大部分VFA直接從瘤網胃吸收進入血液，約20%進入瓣胃和真胃吸收，只有少部分隨食糜進入小腸。丁酸在瘤胃上皮中主要參與線粒體內的生酮作用，約80%的丁酸轉化為酮體（乙酰乙酸和β-羥基丁酸），該過程產生的ATP將為瘤胃上皮細胞提供80%以上的能量來源［16-17］。酮體主要來自瘤胃中產生的丁酸，但在哺乳初期，它們也來自脂肪組織的代謝。VFA代謝產生的酮體、乳酸及丙氨酸等進入血液后也是合成動物性產品（羊肉或牛奶）的重要前體物質，與動物生產性能的發揮息息相關。

瘤胃上皮細胞吸收的VFA，在瘤胃內腔以解離狀態和未解離狀態兩種形式存在［18］，通過氧化代謝通路氧化產生CO2，之后經過碳酸酐酶的催化作用產生碳酸，碳酸又水解成氫離子和碳酸氫根離子。由于Na+吸收與H+分泌到腔內的含量增加相關，因此Na+/H+交換劑是影響細胞內VFA解離產生H+的主要原因［19］。腔內H+的增加會促進腔內微環境中VFA的質子化，從而促進HSCFA的被動擴散［19］。瘤胃上皮的SCFA-/HCO3-轉運蛋白可以將SCFA-轉運到瘤胃上皮細胞質基質內［20-21］。研究表明，由上皮碳酸酐酶合成或基底外側吸收而分泌的碳酸氫鹽可穩定瘤胃pH值［22］。在瘤胃上皮發現的陰離子交換劑也有助于碳酸氫鹽和SCFA-的交換，這進一步有助于提高瘤胃pH值［23］。

反芻動物瘤胃上皮具有獨特的代謝機制，可防止外周血中丁酸的出現，即瘤胃上皮中的高丁酰輔酶合成酶活性可確保丁酸的快速活化，由上皮細胞氧化成β-羥基丁酸。丁酸通過瘤胃上皮代謝，很容易從肝臟門脈血液中移除高位丁酰輔酶A合成酶活性，可確保快速活化和隨后對酮體的代謝。來自綿羊肝臟的酰基輔酶A合成酶特異性地作用于C3至C7直鏈脂肪酸。酰基輔酶A來自綿羊腎的合成酶對C3至C7直鏈脂肪酸具有特異性［24］。這些VFA是通過碳水化合物在瘤胃中發酵產生的，并且在反芻動物中主要用作變性基質。反芻動物優先利用VFA可能與脂肪酸活化酶的水平有關。而且，酰基輔酶A合成酶通常是非平衡酶，可以在控制整個細胞過程中發揮作用。因此，乙酸、丙酸和丁酸活化反應可以作為VFA代謝中的重要調節步驟［24］。

幼齡反芻動物的瘤胃很小且功能尚未發育完全，占總胃腸道容積的30%，只表現乳頭發育的原始狀態，但成年綿羊的瘤胃占胃腸道容積的80%，且瘤胃乳頭發育基本完全，瘤胃上皮細胞發生角質化［25］。瘤胃上皮代謝變化與形態發育相協調，包括葡萄糖氧化減少，VFA氧化及酮體量增加［26］。犢牛單獨飼喂母乳時瘤胃幾乎沒有發育，但是向幼齡反芻動物飼喂固體飼料后，瘤胃體積和重量以及乳頭長度和密度都明顯增加［27］。由此說明，瘤胃的生長和肌肉的發育前提是存在固體飼料，而瘤胃微生物發酵產生的VFA也是瘤胃上皮形態及功能發育所必需的。

有研究表明，丁酸對瘤胃上皮發育的刺激作用最大，丙酸對瘤胃上皮的刺激作用略小于丁酸，但遠大于乙酸所產生的刺激作用。因此，可以合理地預測，瘤胃上皮的發育程度與化合物的生理或生化活性有關。據報道稱，瘤胃中脂肪酸增加會導致瘤胃血流量增加，且相對增加速率為丁酸＞丙酸＞乙酸［28］。有研究發現，瘤胃乳頭的生長很可能是瘤胃壁代謝某些化合物或脂肪酸對血流量影響的結果［28］。在體外試驗培養基中添加丁酸可抑制瘤胃上皮細胞對葡萄糖的利用，同樣，添加葡萄糖也抑制對丁酸的利用［29］。也有研究表明，在羔羊84日齡前，葡萄糖和丁酸被瘤胃上皮細胞利用的效率隨日齡增長變化不明顯，一直到42日齡后才在培養基中檢測到β-羥丁酸，但到84日齡時，β-羥丁酸的濃度已經接近成年水平［30］。研究發現，隨著羔羊日齡的增加（0-84日齡），瘤胃上皮細胞3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶和乙酰乙酸輔酶A硫解酶的mRNA表達量也在上升，到84日齡時即達到成年水平，且不受日糧和瘤胃內VFA的影響［14］，表明瘤胃上皮的代謝功能隨日齡的增長而逐漸增強。

2 丁酸與幼齡反芻動物瘤胃上皮發育

2.1 瘤胃內丁酸的主要來源

幼齡反芻動物的瘤胃尚未發育完全，因此瘤胃中丁酸的主要來源是飼喂乳中存在的丁酸。盡管母乳中的游離丁酸濃度相對較低（0.16 g/L），但它可能足以影響瘤胃的發育和功能［31］。隨著反芻動物日齡的不斷增加，瘤胃中的丁酸主要是由瘤胃微生物發酵碳水化合物而產生。在瘤胃中產生的3種主要VFA（乙酸，丙酸和丁酸）中，丁酸含量最少，根據日糧組成，其在總發酵酸中的摩爾比例可在5%-20% 之間［32］。

2.2 日糧丁酸補飼

幼齡反芻動物剛出生時主要飼料來源是液態奶，攝入的固體飼料含量較少，此時瘤胃微生物菌群體系尚未健全。這導致瘤胃中可利用的丁酸非常低，直至反芻動物大量攝入固體飼料并建立瘤胃微生物區系和瘤胃發酵模式后，瘤胃中丁酸水平才顯著增加［33-34］。此外，由于考慮到經濟效應，代乳料通常代替全脂乳被用作幼齡反芻動物的日糧。但有研究表明，代乳料會使瘤胃發育遲緩，主要是由于其缺乏乳脂以及植物來源的抗營養因子［35］。并且植物（棕櫚油，椰子油）或動物（豬油，牛脂）替代品基本不能滿足幼齡反芻動物所需的丁酸含量。因此，日糧丁酸補飼可以作為一種促進幼齡反芻動物瘤胃發育的手段。

2.2.1 丁酸的性質和功能 丁酸又稱酪酸，為無色至淺黃色透明油狀液體，有腐臭的酸味。與水混溶，易溶于有機溶劑。丁酸可以從哺乳動物腸道中膳食纖維的細菌以及汗液甚至糞便中提取，也是牛乳的成分之一［36］。丁酸有抑制腫瘤細胞增殖分化，誘導癌細胞凋亡，增強機體免疫和抗病能力，維護腸道的正常機能的作用［37-38］。

2.2.2 日糧丁酸的來源和形式 丁酸主要以丁酸鹽或丁酸酯的形式作用［39］，相對于游離丁酸，使用丁酸鹽或丁酸酯的主要優點是它們在飼料生產過程中更穩定，緩解丁酸的腐臭味，不易快速揮發且更易于處理［31］。然而，不同來源的丁酸添加劑具有不同的性質和作用。丁酸鈉是丁酸最常用的添加形式，性價比較高，且易溶于水并迅速在水溶液中解離［40］。日糧中添加的丁酸鈉在瘤胃中迅速解離并且大部分被胃腸道吸收。與丁酸鈉相比，丁酸鈣在水溶液中較難溶解，少部分可以被小腸消化吸收。當丁酸以甘油單酯，二甘油酯或三丁酸甘油酯形式添加時，必須從甘油中釋放出來才能促進瘤胃上皮的發育。

日糧丁酸補飼的效果可以通過保護丁酸在胃中的釋放和利用來調節。通常采用微囊化和脂肪包衣來達到此目的［41-42］。當丁酸以保護形式添加時，僅在瘤胃中部分釋放，大多數活性物質在小腸中逐漸釋放［43］。當以無保護形式補飼時，丁酸被胃腸道近端部分的上皮細胞迅速吸收，并且不能在血液和近端小腸的內容物中檢測到［44］。

2.2.3 日糧丁酸的補飼方式 犢牛的瘤胃發育在很大程度上取決于營養因素，初生犢牛提前飼喂固體飼料可加速其生長，這在早期斷奶干預中尤為重要［45］。自由采食固體飼料對犢牛瘤胃的重量，體積和功能的發育有積極影響［46］。此外，從反芻動物剛出生開始就攝入固體飼料會增加犢牛對固體飼料的攝入量，并且可能對瘤胃微生物區系，瘤胃發酵及其瘤胃上皮的形成產生積極影響［47］。瘤胃中的發酵產物，例如VFA（主要是丁酸和少量的丙酸），是瘤胃上皮細胞發育的主要刺激物［28］。液態飼料（初乳，牛奶或代乳品）是幼齡反芻動物最重要的營養來源。因此，實踐中給犢牛飼喂數量有限的液態奶和含碳水化合物飼料的混合物，這些混合物迅速發酵成丁酸和丙酸，以加速瘤胃發育［48］。羔羊從2月齡開始采食固體飼料，這種飼料經瘤胃微生物發酵產生VFA。幼齡反芻動物出生時，瘤胃上皮細胞以相似的速率氧化葡萄糖和丁酸。在斷奶時（42-56日齡）葡萄糖氧化速率降低，丁酸變成主要的氧化底物［30］。此外，在斷奶時，使丁酸生成酮體β-羥基丁酸的瘤胃上皮細胞增加了六倍［30］。有研究表明，在犢牛斷奶前后的飼糧中添加丁酸鈉可使斷奶犢牛瘤胃乳頭的長度和寬度有效增加，肌層厚度也有增加趨勢［30］。在幼齡反芻動物代乳料或開食料中添加丁酸會有缺點，即瘤胃上皮細胞強烈增殖，特別是分化和成熟導致角質層增厚，瘤胃角化過度會影響瘤胃上皮對VFA的吸收［49-50］。此外，研究表明，日糧添加丁酸會降低綿羊瘤胃食糜中的纖維素分解酶和木聚糖分解酶的活性，而瘤胃中的淀粉分解酶活性較高［51］。無論是在代乳料還是在開食料中直接添加丁酸，其特殊的腐臭味會降低反芻動物的采食量以及平均日增重［52-53］。采用包被形式的丁酸比單一添加丁酸時經濟成本高。同時，也有研究表明，使用瘤胃瘺管動物，直接往其瘤胃內灌服丁酸也可促進瘤胃的發育［54］，但此法對反芻動物機體產生應激。Liu等［55］發現飼喂母乳的條件下補飼開食料，同時采用口腔灌服丁酸鈉的形式對幼齡反芻動物傷害相對較小，更能反映丁酸對幼齡反芻動物的實際作用，并且更加貼近于生產。

2.3 丁酸對瘤胃上皮發育的影響

丁酸調控幼齡反芻動物瘤胃上皮發育是一個歷久彌新的話題。早期研究主要從宏觀層面闡述了丁酸對幼齡反芻動物瘤胃發育的影響。Sander等和Hodson［56-57］通過瘤胃瘺管給犢牛灌注乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉、氯化鈉和葡萄糖發現，丁酸鈉和丙酸鈉刺激瘤胃乳頭生長的能力比乙酸鈉、氯化鈉和葡萄糖的強。添加丁酸鈉能明顯促進瘤胃黏膜的發育，瘤胃乳頭的生長可能與瘤胃壁代謝丁酸供能直接相關。Walker等［58］也發現，短鏈脂肪酸能促進瘤胃乳頭生長并能產生一定的生化作用，但在7周齡和9周齡斷奶羔羊中瘤胃發育遲緩，丁酸利用率下降。Flatt等［59］研究表明，低纖維日糧或乙酸、丙酸、丁酸和乳酸的混合鈉鹽溶液都會促進瘤胃乳頭的發育。進一步研究發現，在飼喂犢牛的乳糖溶液中添加丁酸鈉可增加瘤胃乳頭長度［60］。在犢牛代乳料中添加丁酸鈉刺激瘤胃發育，增加了乳頭長度與寬度，并發現在代乳料與發酵劑混合物日糧中添加丁酸鈉，更有利于犢牛的瘤胃上皮發育［4］。同時，在代乳料中添加丁酸鈉還可促進瘤胃上皮對丁酸，丙酸和乙酸的吸收代謝，增加瘤胃乳頭的長度及寬度［61-62］。在犢牛開食料中添加0.3%的丁酸鈉也可有效增加瘤胃乳頭長度和寬度，促進瘤胃上皮發育［47］。上述早期研究結果表明，在代乳料/開食料中添加或是通過瘤胃灌注適量丁酸可有效促進幼齡反芻動物瘤胃上皮形態發育并促進其吸收代謝功能。

隨著研究的深入，丁酸調控瘤胃上皮發育的研究逐漸從宏觀層面延展到細胞和分子水平。Mentschel等［63］研究發現，日糧中添加丁酸刺激瘤胃黏膜基底層干細胞細胞的有絲分裂，進而促進細胞的增殖，使乳頭長度增加。Sakata等［64］也證實了這一觀點，短鏈脂肪酸是消化道的生理腔內營養因子，可以促進瘤胃上皮細胞的分裂。體外細胞培養試驗發現，丁酸和胰島素相互作用能促進瘤胃上皮細胞 DNA 合成［65］。Gálfi等［66］發現丁酸抑制瘤胃上皮細胞分化作用是依賴pH變化的過程，因為瘤胃上皮細胞在不同pH值下的代謝和運輸過程不斷變化，加上局部生長因子，可廢除丁酸的抑制作用。進一步研究表明，丁酸鈉對瘤胃上皮細胞生長具有濃度依賴性的抑制作用［67］。將較高濃度（5 mmo/L）的丁酸鈉添加到瘤胃上皮細胞培養物中，促進了角質化細胞的形成，表明高濃度的丁酸在誘發瘤胃上皮細胞過度角質化中起重要作用［68］。在體試驗也進一步證實了這一觀點，長期瘤胃灌注高濃度的丁酸會導致瘤胃上皮角質層增厚，細胞增殖減少［69］。Jamila等［70］每天給山羊瘤胃內灌注0.3 g/kg體重的丁酸鈉，結果發現瘤胃上皮層的乳頭大小增加，這與產生較高的細胞層數目有關，并且細胞周期蛋白與mRNA表達水平增加。研究表明，丁酸通過改善瘤胃上皮細胞增殖和凋亡相關的基因表達促進瘤胃乳頭生長。在上皮細胞生長過程中，細胞增殖速度明顯高于細胞凋亡速度。Liu等［55］研究發現，口服丁酸鈉可以改善斷奶羔羊的動物生產性能，促進瘤胃乳頭生長，并增強與瘤胃上皮VFA攝取和代謝相關的基因的表達。丁酸可以刺激微生物發酵產物的吸收和代謝，調節參與維持細胞內穩態的蛋白質的活性，以及參與調控瘤胃上皮組織內代謝物的細胞間流動的蛋白質的活性，這些作用促進了瘤胃上皮組織的代謝發育［71］。

丁酸不僅是瘤胃上皮細胞的主要能量來源，而且還是間接刺激上皮細胞增殖的信號分子［54］。丁酸可以通過內分泌和旁分泌的方式來發揮作用，影響激素和生長因子如IGF-1的分泌，進一步促進上皮細胞增殖［9，72］。有研究表明，飼喂非常低水平的丁酸也可促進幼齡反芻動物的瘤胃上皮發育［73-74］，因此丁酸對瘤胃上皮生長和成熟的影響可能更多地依賴于生長因子的間接作用模式而不是直接為細胞增殖提供能量。IGF-1通過信號轉導途徑加速細胞有絲分裂，細胞周期運轉，促進瘤胃上皮細胞增殖分化以及表面積增加［75］。大量研究表明，體外試驗注射不同的IGF-1的濃度會改變瘤胃乳頭的數量和大小，DNA的合成也會發生變化［76］。有研究發現，IGF-1和丁酸可通過協同作用顯著促進DNA的合成和增殖，因此IGF-1和丁酸對瘤胃上皮細胞的生長具有協同促進作用［77］。

3 小結與展望

丁酸作為反芻動物瘤胃微生物降解植物性飼料的主要產物，也是瘤胃上皮及宿主重要的能量來源。本文主要介紹了幼齡反芻動物瘤胃上皮生長發育特點以及丁酸對其發育的影響。開食料/代乳料添加或是口腔/瘤胃灌注合適濃度的丁酸能促進幼齡反芻動物瘤胃上皮發育，主要表現為瘤胃乳頭的增長和細胞層的增厚，該過程與瘤胃上皮細胞增殖的加速密切相關。但是過高濃度的丁酸反而對瘤胃上皮的發育產生不利影響，主要表現為瘤胃上皮的過度角質化。所以真正明晰不同幼齡反芻動物（犢牛或羔羊）在不同生理階段對丁酸的需求量將是未來的研究重點。同時，丁酸促進瘤胃上皮發育的深層機理尚不清楚，還有待進一步探索。