乙醇對瘤胃液接種稻秸的體外發酵產物及細菌群落結構的影響

林淼 王闊鵬 陳映良 孫文婧 封麗梅 胡梓軒

（揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009）

2016年全國農村可再生能源統計表明，我國農作物秸稈的秸稈綜合利用率達到 81.68%［1］。秸稈的利用途徑為肥料化、飼料化、燃料化、基料化和原料化，利用率分別為47.20%、17.99%、11.79%、2.23%、2.47%［2］。中國產業信息網發布的2018年全國水稻產量為2.027×108t，根據畢于運提出的我國水稻草谷比平均值為0.90［3］，可以推算2018年我國全年水稻秸稈產量為1.824×108t。稻秸是我國主要的作物秸稈類型，我國水稻秸稈年產量大，探索利用稻秸的新途徑，減輕對環境的壓力，是急需解決的難題。

Martinez等［4］報道與飼喂相同飼料的瘤胃液供體羊相比，體外Rusitec發酵培養16 d后，自動核糖體基因間隔分析（ARISA）結果表明，未檢測到特異性細菌群落的變化；而Zapletalova等［5］證明了利用雙外流連續培養技術，在接種瘤胃內容物10 d內，瘤胃細菌群落結構發生了變化，特別是提高了厚壁菌門（Firmicutes）：擬桿菌門（Bacteroidetes）的比例。華金玲等［6］以尼龍袋試驗表明，水稻秸稈的72 h瘤胃降解率為35.41%；張軼鳳等［7］以山羊瘤胃液發酵稻秸，72 h尼龍袋瘤胃降解率為30.57%。因此，根據前人的研究表明，稻秸的體外72 h瘤胃降解率較低。而Lin等［8］以柳枝稷和DDGS為主要碳氮源，對瘤胃液進行長時間的頻繁接種，結果表明即使在低消化率生物質為主要底物的情況下，來自瘤胃的混合培養細菌群落依然可以在體外維持。瘤胃液和厭氧污泥共同接種稻秸培養196 d的結果也表明，稻秸的木質纖維素在體外被成功高效地降解［9］。

目前厭氧發酵稻秸成為生產SCFA是的一種新型的利用方向，在替代以石化為原料的不可再生資源中作為化學平臺原料具有優勢。己酸是瘤胃發酵纖維素產生的SCFA之一，己酸在抗菌劑、飼料添加劑、風味劑、化工原料方面有較大的應用潛力［10-13］，且經濟價值是乙醇的10倍以上。Lin等［8］報道體外發酵柳枝稷時添加乙醇可以顯著提高乙酸和己酸的產量，在有機廢棄物中添加乙醇可以顯著提高己酸的產量［14］，說明乙醇是己酸合成的主要供氫體［15］。目前，長期培養和連續接種對稻秸厭氧發酵生產SCFA的產量和微生物群落的影響少有報道。

本文研究了水稻秸稈與瘤胃液共培養8代后SCFA的產量變化，同時還研究了添加乙醇對瘤胃細菌發酵稻秸生產SCFA的變化，并進一步闡述了細菌群落結構特征，以期為揭示瘤胃細菌發酵稻秸產酸的特點，并為稻秸的利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻秸稈和玉米酒精糟（DDGS）來自揚州大學動物營養與飼料工程技術研究中心。稻秸經65℃烘干48 h后得到風干樣品，再粉碎過0.50 mm篩，密封備用。體外培養底物以0.80 g稻秸和0.16 g DDGS配制而成。瘤胃液來自揚州大學實驗農牧場（高郵）的帶有永久性瘤胃瘺管的山羊。在晨飼前采集瘤胃內容物，經4層無菌紗布過濾后，迅速帶回實驗室。

培養緩沖液參照Menke（1979）［16］配制：微量元素溶液（A液，1 L）：13.2 g CaCl2·2H2O，10.0 g MnCl2·4H2O，1.0 g CoCl2·6H2O，8.0 g FeCl3·6H2O ；緩 沖 溶 液（B液，1 L）：4.0 g NH4HCO3，35.0 g NaHCO3；常量元素溶液（C 液，1 L）：5.7 g Na2HPO4，6.2 g KH2PO4，0.6 g MgSO4·7H2O；0.1%（W/V）刃天青溶液。再以蒸餾水400 mL + A液0.1 mL + B液200 mL + C液200 mL + 刃天青溶液1 mL的比例配制。現用現配。

試驗使用150 mL體積的厭氧培養瓶為培養裝置，采集瘤胃液前稱取稻秸和DDGS于培養瓶中，加入15 mL緩沖液，持續通入CO210 min，加入2.5%（W/V）硫化鈉溶液0.1 mL后，膠塞密封，光照至刃天青褪色。每瓶加入2 mL瘤胃液，膠塞密封加鋁蓋后，于39℃靜置培養3 d，視為第1代。以不加乙醇為對照組，以加0.2 mL乙醇為試驗組，每組3個平行。

每3 d傳代一次，傳代量為2 mL，其它操作同上。共培養8代。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理 在每次傳代前和3 d培養結束時，以氣壓表（DPG1000B15PSIG-5，CeComp Electronics Inc.）測定瓶內氣壓（psi）。以pH計（PB-21型，Sartorius）測定發酵液pH值。按Lin等［8］的方法對測定短鏈脂肪酸進行去蛋白操作：吸取0.6 mL發酵液，加入含有0.3 mL硫酸銅溶液（12.5%，M/V，含巴豆酸0.002%，M/V）和0.6 mL碳酸鈣溶液（26.45%，M/V）的去蛋白溶液中，漩渦混勻后在-20℃冰箱中冷凍過夜；解凍后以12 000 r/min離心10 min，經0.22 μm水相針式濾膜過濾，4℃保存備測。收集第8代的發酵混合液，按Lin等［8］方法分離細菌。具體方法為：用30 mL提取緩沖液（100 mmol/L tris/HCl，10 mmol/L EDTA，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0）將樣品（固液混合）轉移至攪拌杯中，高速攪拌2 min后完全無損經無菌2層紗布過濾入50 mL離心管，在12 000 r/min離心30 min，棄去上清液，再用提取緩沖液復懸后，送北京諾禾致源生物技術有限公司進行總細菌DNA的提取和高通量測序分析。

1.2.2 測定方法 采用日本島津GC-14B氣相色譜法測定短鏈脂肪酸含量。氣相色譜儀參數：色譜柱為毛細管柱，柱溫 130℃，汽化溫度180℃，氫離子火焰檢測器，檢測溫度 180℃，壓力為 60 KPa，氫氣壓力為 50 KPa，氧氣壓力 50 KPa，靈 敏 度（檔）為 101，衰減 3.0，以氮氣為載氣，進樣量1.0微升，測定樣品的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸的含量。

細菌群落結構分析采用高通量測序Illumina Hiseq平臺（北京諾禾致源生物技術有限公司）。引物選用16S V4區的515F和806R（515F 5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'，806R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）進行擴增。按張雪姣［17］的方法處理序列，使用Mothur軟件以一致性（Identity）為97%將序列聚類成為OTUs，繪制韋恩圖分析共同存在的OTU和特有的OTU；通過UPGMA（Unweighted pair-group method with arithmetic mean）繪制聚類樹分析樣本間的相似性；選用LEfSe統計分析方法對分組樣品的物種組成和群落結果進行差異顯著性檢驗；使用CCA（Canonical correspondence analysis）方法分析細菌群落與SCFA比例的相關性。

1.2.3 統計方法 以SPSS 21.0軟件中單因素ANOVA方法進行差異顯著性分析，以組別為變量，用Tukey進行多重比較。對于不同處理指標，在不服從正態分布時，做非參數檢驗重新分析顯著性。試驗結果以“平均數±標準差”表示，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 乙醇對稻秸體外發酵的短鏈脂肪酸產量變化

由表1可見，無論是瘤胃液還是體外發酵液，乙酸是占比例最大的SCFA，丙酸和丁酸的比例相近。經體外培養傳代8次的稻秸發酵液的總短鏈脂肪酸產量顯著高于瘤胃液（P＜0.05）。與未添加乙醇的稻秸發酵液相比，添加乙醇顯著提高了乙酸、戊酸和己酸的比例，降低了丙酸和丁酸的比例（P＜0.01），總SCFA產量及異丁酸和異戊酸比例無顯著差異。

表1 乙醇對稻秸瘤胃體外發酵的短鏈脂肪酸產量的影響（N=3）

2.2 乙醇對稻秸體外發酵細菌群落結構的影響

由圖1可知，本試驗共測定得到911個OTU，共有的 OTU 個數為292，占總OTU數量的32.05%。瘤胃液與稻秸發酵液共有的OTU為321個，瘤胃液與添加乙醇的稻秸發酵液共有的OTU為322個，而稻秸發酵液與添加乙醇的稻秸發酵液共有的OTU為549個。山羊瘤胃液共得到539個OTU，稻秸發酵液得到639個OTU，稻秸發酵液添加乙醇后共得到633 OTU。瘤胃液有188個特有的OTU，占總OTU數量的20.64%，稻秸發酵液有61個特有的OTU，占總 OTU數量的6.70%；添加乙醇的稻秸發酵液有54個特有的OTU，占總OTU數量的5.92%。

使用UPGMA對樣品進行基于Weighted Unifrac方法的門水平聚類分析，結果見圖2。由圖2可知，3個組可分為2大類，其中瘤胃液和稻秸發酵液的細菌群落相似度較高，添加乙醇的稻秸發酵液單獨為一類，說明體外傳代8次的稻秸發酵液與瘤胃液親緣關系較近，而添加乙醇顯著改變了細菌區系。進一步分析菌門的相對豐度可知，山羊瘤胃液中以擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）為主要菌門（分別為72.35%和24.70%）。以稻秸和DDGS為發酵底物，連續傳代8次后，發酵液的擬桿菌門相對豐度下降，厚壁菌門相對豐度升高（分別為57.98%和32.71%），且添加0.2mL乙醇顯著提高了厚壁菌門和放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度（分別為51.91%和12.27%，P＜0.01）。

本試驗選取相對豐度前20的細菌，進行屬水平相對豐度的比較（圖3）。由圖3可見，瘤胃液中有76.24%的細菌無法用數據庫定性。瘤胃液中未定性的理研菌屬（unidentifiedRikenellaceae）和未定性的普雷沃氏菌屬（unidentifiedPrevotellaceae）相對豐度分別為0.64%和6.35%，體外培養使這兩個菌屬的相對豐度顯著升高（39.82%和13.10%，P＜0.05），但添加乙醇使該菌屬相對豐度顯著降低（0.42%和1.84%，P＜0.05）。與瘤胃液相比，雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的相對豐度在秸稈發酵液中無顯著變化（0.17%和1.65%），但添加乙醇顯著提高了該菌屬的相對豐度（24.82%，P＜0.01）。同樣地，添加乙醇顯著提高了未定性的毛螺菌屬（unidentifiedLachnospiraceae）、產琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）、脫硫弧菌菌屬（Desulfovibrio）和未定性的梭菌屬（unidentifiedClostridiales）的相對豐度（P＜0.05）。相反，秸稈與瘤胃液體外共培養使未定性的瘤胃球菌屬（unidentifiedRuminococcaceae）和未定性的擬桿菌屬（unidentifiedBacteroidales）相對豐度降低（P＜0.01）。

圖1 稻秸體外發酵及添加乙醇的瘤胃細菌Venn圖

圖2 稻秸體外發酵及添加乙醇的瘤胃細菌群落間相似性聚類樹

稻秸發酵液的LEfSe分析柱狀圖和進化分支圖見圖4，LDA score（柱形長度）大小代表差異物種的影響大小。由圖可知，添加乙醇后出現了不同的Biomarker，且乙醇使顯著性差異物種數增加。在門水平上，稻秸發酵液中僅擬桿菌門內的細菌存在顯著差異；但添加乙醇后，3個主要門的細菌存在顯著差異，分別為厚壁菌門、放線菌門和變形菌門。進一步分析可得，稻秸發酵液中有9個特異性的Biomarker，根據LDA score（柱形長度）的大小，依次為擬桿菌（綱、目、屬）、理研菌（科、屬）、普雷沃氏菌（科、屬）、棲瘤胃普雷沃氏菌和擬桿菌RM68。而添加乙醇后有21個特異性的Biomarker，根據LDA score（柱形長度）的大小，依次為雙歧桿菌（綱、科、屬）、放線菌（綱、屬）、厚壁菌屬、梭菌芽孢桿菌（綱、目）、毛螺旋菌科、脫硫弧菌（綱、目、屬）、變形菌（門、綱）、丹毒絲菌（綱、目、科）、Solobacterium屬、氫化厭氧細菌屬、硫酸鹽還原菌和毛螺旋菌AC2012。

為分析發酵液細菌群落與發酵參數間的關系，以細菌群落在門水平上的相對豐度數據為物種數據，發酵液乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸比例為變量，進行了CCA分析（圖5）。由圖5可知，稻秸發酵液的3個平行樣本（RS1、RS2、RS3）較集中，添加乙醇的稻秸發酵液的3個平行樣本（RS.E1、RS.E2、RS.E3）也較集中，說明組內3個樣本的群落結構相近，但RS和RS.E相距較遠，說明乙醇對細菌群落結構的影響較大。第1排序軸和第2排序軸分別對稻秸發酵液的細菌群落變化解釋率為51.46%和41.9%，前兩軸共解釋了總變異的93.36%，在對細菌群落的解釋中起主導作用。其中丙酸比例（r=-0.67）、戊酸比例（r=0.82）和己酸比例（r=0.80）與第1排序軸相關性較高，乙酸比例（r=0.77）、丁酸比例（r=-0.85）與第2排序軸相關性較高。因此，短鏈脂肪酸對稻秸發酵液的細菌區系多樣性存在重要作用。

圖3 乙醇對瘤胃細菌相對豐度的影響（屬水平，相對豐度前20）

3 討論

體外混合瘤胃細菌培養和每3 d傳代一次的培養條件可以保證秸稈的正常發酵，稻秸體外發酵的SCFA產量因培養時間、發酵底物而不同。艾平等［18］報道，35℃的中溫發酵使稻秸的產酸率最高，但更高溫度（55℃和70℃）的處理不影響SCFA的組成；牛俊玲等［19］以堆肥樣品為材料篩選高效纖維素降解菌，發現其在發酵前5 d對稻秸的分解活性最高；張蘊琦提出，用混合菌系降解水稻秸稈的效果高于單菌株，且經過馴化后的菌株降解能力增強［20］。短鏈脂肪酸是瘤胃微生物降解纖維類物質的主要產物，其中以乙酸、丙酸和丁酸為主，異丁酸、異戊酸、戊酸和己酸的比例較低。Mirni等［21］和陳安等［22］報道，稻秸原料接種山羊瘤胃液體外發酵48 h的總揮發性脂肪酸產量為37.3-65.5 mmol/L；本研究結果表明，稻秸接種山羊瘤胃液體外發酵72 h的總SCFA產量為78.34 mmol/L，這一結果與楊紅建等［23］研究結果一致，說明本試驗體外發酵稻秸的短鏈脂肪酸產量在正常范圍內。Seedorf等［24］報道，電子供體是促進SCFA的碳鏈延伸，其中乙醇參與乙酸和丁酸發酵，是己酸合成的重要底物。外源乙醇作為電子供體是影響己酸生產過程中碳鏈延伸的主要因素［15］。Roghair等［25］在有機廢棄物中添加乙醇進行厭氧發酵，結果表明，添加乙醇能有效提高己酸的生產速率。本試驗中體外稻秸發酵液的己酸產量是瘤胃液的5倍，添加乙醇的稻秸發酵液己酸產量是瘤胃液的6倍，該結果表明體外發酵可以顯著提高稻秸產己酸的能力。

圖5 瘤胃細菌群落與短鏈脂肪酸產量相關性分析（屬水平，典型對應分析）

本試驗的Venn圖和UPGMA聚類分析都表明，秸稈發酵液添加乙醇后，瘤胃細菌多樣性發生了變化。擬桿菌門和厚壁菌門被認為是瘤胃中的優勢菌門，成年羊瘤胃中這2個菌門的相對豐度總和＞90%［26］，本試驗山羊瘤胃液的菌群結構與之相似。瘤胃細菌的菌群相對豐度受日糧結構的影響。范文斌等研究表明，放牧蒙古羊采食粗纖維高的牧草時，厚壁菌門相對豐度最高，擬桿菌門次之［27］。厚壁菌門主要功能是分解纖維類物質，擬桿菌門的主要功能是分解非纖維類碳水化合物和蛋白質［28］。本試驗體外稻秸發酵液的菌門結構發生了顯著的改變，同時添加乙醇后優勢菌門相對豐度發生了變化。Zapletalova等［5］雙外流連續培養接種瘤胃內容物培養玉米青貯10 d內，擬桿菌門相對豐度下降，放線菌門相對豐度增加，這與本研究結果一致。結合屬水平豐度分析和LEfSe分析柱狀圖結果也可以看出，秸稈發酵液中添加乙醇顯著增加了Biomarker的數量，其中雙歧桿菌（綱、科、屬）、放線菌（綱、屬）、梭菌芽孢桿菌（綱、目）、脫硫弧菌（綱、目、屬）發生了主要的變化。雙歧桿菌是腸道中的有益菌，可抑制病原菌的黏附和侵入，該菌發酵產生的主要代謝物為有機酸（乙酸為主），可以通過降低pH值抑制有害菌的增殖［29］；此外，有研究表明低乙醇攝入量（占飲水量的10%）可以有助于小鼠腸道雙歧桿菌發揮優勢菌群的作用，調節腸道內環境［30］。目前對雙歧桿菌在瘤胃內的功能少有報道，但由于雙歧桿菌的主要代謝產物是乙酸，因此推測該菌的增加可為己酸生產提供更多的底物。克氏梭菌（Clostridium kluyveri）是目前明確報道的可利用乙醇和乳酸產生乙酸，再進一步利用乙酸延伸碳鏈產生丁酸和己酸，因此，該菌也是研究己酸生產機理的模式菌株［31］。目前對瘤胃內的克氏梭菌的功能研究未見有報道，但根據本研究結果中梭菌屬相對豐度隨添加乙醇而增加，可推測梭菌在瘤胃細菌產己酸中有重要作用。郭威等［32］從窖泥中分離到的放線菌單獨培養未檢測到己酸產量增加，但其中8株放線菌與己酸菌共培養發現可有效促進己酸菌生產己酸。吳凌等［33］從奶牛瘤胃中分離出一株產琥珀酸放線桿菌，并發現該菌與瘤胃液共培養，顯著提高了乙酸、丙酸和丁酸的比例，降低了乳酸的比例。盡管該研究未檢測其它短鏈脂肪酸，但可以推測放線桿菌在瘤胃體外發酵中對短鏈脂肪酸產量有影響。Yang等［34］報道添加乙醇體外培養15 d后顯著提高了己酸的產量，并且脫硫弧菌屬為主要的細菌屬，Liu等［35］研究也表明脫硫弧菌可利用乙醇作為碳源進行代謝。本試驗結果與這些前人結果相似。此外，從CCA分析中可見，體外秸稈發酵液的細菌群落多樣性受短鏈脂肪酸的影響。同時，本試驗中添加乙醇使厚壁菌門和放線菌門相對豐度顯著升高，提高了雙歧桿菌、放線菌、梭菌和脫硫弧菌屬相對豐度，這可能是導致短鏈脂肪酸產量發生變化的原因。

4 結論

本試驗研究了體外瘤胃液與水稻秸稈共培養條件下添加乙醇對短鏈脂肪酸產量和細菌區系的影響。與體外稻秸發酵液相比，添加乙醇顯著提高了乙酸、戊酸和己酸的比例，降低了丙酸和丁酸比例；同時厚壁菌門和放線菌門的相對豐度顯著升高。試驗結果發現乙醇提高了雙歧桿菌、放線菌、梭菌、脫硫弧菌的不同分類水平的相對豐度，推測這4個菌類在體外發酵水稻秸稈利用乙醇產生己酸上有潛在作用。