p53 突變與結腸癌的研究進展

劉 菲 劉 展

（1.湖南師范大學附屬第一醫院（湖南省人民醫院） 消化內科，湖南 長沙 410000；2.岳陽職業技術學院 基礎醫學部，湖南 岳陽 414000）

結腸癌是常見的消化道腫瘤之一，也是導致人類死亡的主要原因之一。流行病學研究顯示，因結腸癌和/或結腸癌相關并發癥導致的死亡約占所有腫瘤致死人數的10%左右[1]。預計到2035年，全球將新增250 萬結腸癌患者[2]。在50 歲以下人群中，結腸癌發生率逐年增加，以直腸癌和左側結腸癌常見。盡管遺傳、生活方式改變、肥胖和環境因素可能與結腸癌發生有關，但導致結腸癌發生率顯著增長的原因仍不明確。

研究顯示，抑癌或促癌基因發生突變后不斷積累會導致結腸癌的發生和惡性進展。TP53/Trp53（人/小鼠p53 基因）編碼的抑癌基因p53在多種腫瘤發生和發展中具有重要的作用。p53除了具有抑癌作用之外，當p53 在DNA 綁定結構域發生錯義突變時，p53 會突變成促癌基因。但值得注意的是，p53 突變成促癌基因有以下兩種方式，一種是錯義突變的過程中發生原有野生型p53 功能的缺失，另外一種錯義突變的發生增加了具有促癌功能的基因。近年來的臨床和基礎研究顯示，p53 的錯義突變在腫瘤的發生和發展的作用十分復雜，本文就近幾年來p53 突變（包括獲得致癌性突變和丟失野生型功能突變）在結腸癌中作用的臨床和基礎研究結果進行綜述。

1 結腸癌的可能發生機制

1.1 結腸癌與突變基因

大部分的結腸癌都從息肉發展而來。通常從腸腺窩異常增生開始，逐漸發展成贅生性的增生（息肉），到最終發展為結腸癌并轉移、浸潤其他器官，這一過程大致需要10-15 年。而這一過程被稱為多步驟的腫瘤發生，在腫瘤發生、發展的過程中每一個步驟都與特定的抑癌基因或促癌基因的突變有關[3]。近年來全基因組關聯研究（genome-wide associated studies,GWAS）鑒 定出一些與結腸癌密切相關的突變基因，其中包括APC、KRAS、SMAD4 以 及TP53，這些突變基因與80%左右的結腸癌相關[4]。研究發現，包括APC、KRAS、SMAD4 以及TP53 在內的基因突變與獲得干細胞特性、細胞增殖能力增強、分化能力抑制以及DNA 完整性維持能力受損密切相關，而這些改變是腫瘤細胞的特有標志，并且是腫瘤細胞信號通路中關鍵調控基因[5]。另外，在除結腸癌外的多種腫瘤中，同樣也發現了由包括APC、KRAS、SMAD4 以及TP53 在內的基因突變導致的細胞內信號通路改變，提示這些基因發生突變引起的細胞內信號通路改變是關鍵的促癌信號，與腫瘤的類型無關[6]。

1.2 突變基因與多步驟腫瘤發生

近年來由于正常腸道干細胞培養技術的發展，使得能夠在體外培養的條件下模擬體內環境，證實這些突變基因在腫瘤發生和發展中的作用。研究證實在體外培養的正常腸道類器官通過轉基因技術誘導結腸癌發生相關的APC、KRAS、SMAD4以及TP53 中的4 個基因或5 個基因發生突變，誘導系膜細胞表型轉換，再將這些發生表型轉換的類器官移植到正常的小鼠皮下，可以導致結腸癌的發生。這些研究結果進一步證實了多步驟腫瘤發生這一概念，盡管還存在著其他導致腫瘤形成的可能機制存在，例如表觀遺傳的改變等[7]。

2 p53 突變與人結腸癌

2.1 p53 突變導致結腸癌的可能原因

研究顯示p53 種系突變與家族性癌癥綜合征李-佛美尼綜合征（Li-Fraumeni syndrome）密切相關，李-佛美尼綜合征是一種伴發多種起源于不同器官癌癥的臨床綜合征，提示p53 在多種癌癥等發生中均起著抑癌等作用。與之一致的是，在胰腺癌中p53 突變是最常見的致癌突變，占到所有突變基因的43%[8]。在非高突變型結腸癌中，p53 的突變率大約在55%-60%之間，是這一類型的結腸癌中突變率第2 位的基因，突變率占第1位的是APC 基因，其突變率達到了80%以上，但在高突變型結腸癌中，TP53 的突變率大致在20%左右[9]。

研究顯示，p53 發生突變與多種癌癥的預后不佳密切相關，這其中就包括結腸癌。研究同時發現，當結腸癌發生轉移時，p53 的突變率會增加至80%以上。另外，p53 的突變并不發生在結腸瘤樣息肉階段，在此階段p53 的突變率大致在15%-30%左右[10]。這些結果提示p53 突變可能在結腸癌的中晚期起著促癌作用，例如從結腸腺瘤到結腸腺癌的轉變，以及結腸癌的遠端轉移。

包括DNA 損傷、端粒酶丟失、低氧以及營養缺乏在內的細胞應激和促癌信號通路的激活、p53活化等會導致細胞周期停滯、衰老和細胞凋亡。而這些細胞應激性反應都受到p53 調控的下游基因調控，例如p53 下游的p21、Tiger、PAI-1 基因。當p53 失去轉錄活性的時候，會導致這些受到p53 調控的基因過度激活，而這可能是p53 突變導致腫瘤發生的可能原因之一。

2.2 p53 錯義突變與結腸癌的發生和發展

研究發現，在腫瘤細胞中約74%左右的TP53突變為錯義突變，即在DNA 綁定結構域內發生氨基酸替換，其中替換發生頻率最高的氨基酸殘基是R175、G245、R248、R249、R273 和R282[11]。在正常情況下，p53 在空間上的結構為一個四聚體，而發生突變后，將破壞這一結果，影響其正常的功能。研究顯示，當p53 錯義突變發生在小鼠R173H 位點時（人相對應的位點為R175H）會減弱抗癌治療恢復的野生型p53 的功能[11]。但是，進一步的研究發現，在這些頻率最高位點的TP53錯義突變導致的促癌作用可能通過獲得某些功能所引起，盡管每一個位點發生的錯義突變在腫瘤的發生中均有其特定的作用。此外，這些TP53 的錯義突變與結腸癌的預后成明顯的正相關，提示當p53 發生錯義突變獲得某些功能時在腫瘤的進展中可能起著重要的作用。需要注意的是，在非高頻率突變型結腸癌中，超過80%的腫瘤通過雜合攜帶p53 錯義突變而喪失其原本的野生型功能[12]。綜上所述，這些結果提示p53 在最常見的位點發生錯義突變導致其獲得某些功能，促進結腸腺瘤向結腸腺癌的轉變，而額外的雜合錯義突變導致的p53 功能喪失在腫瘤發生晚期會導致更惡性的表現。

在小鼠中已經發現兩種與腫瘤發生相關的可以獲得功能性的p53 錯義突變。過表達R172H或R270H 突變（人相對應的位點為R175H 和R273H）的Trp53 轉基因小鼠會自發腸道和肺部腫瘤，其機制與p53 在細胞核內聚集相關，但敲除p53 基因不會發生自發性腫瘤。除此之外，還發現了其他一些與p53 錯義突變導致腫瘤發生的機制。例如，發現p53 突變通過促進Rub 耦合蛋白與整合素蛋白以及肝生長因子受體結合，導致EGFR/整合素信號通路和肝生長因子信號通路的激活，引起腫瘤細胞侵襲和遷移能力增強[12]。p53 突變還可以通過結合p63 和p73，加速轉化生長因子-β（TGF-β）介導的腫瘤轉移以及PDGFβ 信號通路。p53 突變增加干細胞池和腸內皮細胞的數量，而這可能導致腫瘤增生能力增強。

近年來，有研究發現p53 突變同樣可以通過表觀遺傳改變介導大量的基因表達異常，這其中包括促癌基因。當p53 發生錯義突變時（包括發生在R175H 和R273H 的錯義突變），可以通過與SWI/SN 染色質重構復合體結合或者促進MLL1、MLL2 和MOZ 甲基化和乙酰化組蛋白，進一步通過表達遺傳促進啟動子的激活導致整個基因組轉錄異常。這些結果提示在p53 突變高頻位點發生突變，可以通過調整整個染色體的穩態導致轉錄的激活，上調促癌基因的表達導致結腸癌的發生。

2.3 p53 突變丟失野生型功能與結腸癌

APC 基因突變激活Wnt 信號通路在結腸癌的發生和發展中起著至關重要的作用。在正常的腸系膜上皮細胞中，來源于基質細胞產生的Wnt 的配體刺激Wnt 上的卷曲受體，破壞APC、β-連環蛋白和GSK3β 復合體，導致β-連環蛋白的降解減少。因此，Wnt 信號通路維持β-連環蛋白的穩定性，促進其向細胞核內的聚集，與TCF形成復合體，進一步促進Wnt 信號通路下游基因的表達，以維持干細胞的正常數量和功能[13]。因此，APC 基因突變通過過度持續激活腸上皮細胞內Wnt 信號通路促進腸道癌癥的發生和發展。

在使用藥物（APCmin）或者基因敲除（APCΔ716）誘導APC 基因的小鼠模型中，持續激活Wnt 信號通路，會導致小鼠自發形成多發性腸息肉。為研究p53 突變引起的野生型p53 功能缺失在結腸癌發生、發展中的作用，研究者們構建了一些突變小鼠。在以c57bl/6 和129 雜合的基因背景APCmin 小鼠中加入無效等位基因的p53并沒有導致結腸癌的進展加重[14]。有趣的是，APCminTrp53-/-基因背景為純c57bl/6 小鼠時，結腸腫瘤的侵襲能力減弱。這些研究結果提示，p53突變引起的野生型p53 功能缺失在結腸癌早期的侵襲、轉移中可能不起重要的作用，同時小鼠基因背景不一致也會導致結果不同。

2.4 p53 錯義突變在結腸癌進展中的作用

在純合子Trp53R270H/R270H小鼠中，p53 持續在細胞核內聚集。來源于APCΔ716 小鼠的類器官由于Wnt 信號通路的持續激活和分化障礙，其大體形態表現為橢圓形，但是當p53 缺失時，這一表型不發生改變[15]。相反，來源于純合子Trp53R270H/R270H小鼠的類器官則表現出與Trp53 缺失小鼠完全不同的表型改變。這種腫瘤的腺狀結構與Wnt 信號通路激活的程度有關。這些與p53 R270H 位點突變的蛋白表達水平相關的腫瘤表型可以通過使用異羥肟酸顯著抑制，異羥肟酸是一種組蛋白脫乙酰酶抑制劑，其通過Mdm2 介導的泛素化促進降解發生突變的p53 蛋白。

另外，與皮下移植來源于APCΔ716Trp53Null小鼠的類瘤組織相比，移植APCΔ716Trp53R270H/R270H小鼠的類瘤組織表現出更嚴重的侵襲表型，例如上皮間質轉化過程中細胞的形態表現出更多的分支和細胞外有大量的纖維環境和活化的成纖維細胞。當p53 發生突變的位點在R273H 時，腫瘤組織也表現出同樣的形態，即在腫瘤組織周圍存在大量的細胞分支[16]。研究發現腫瘤外環境中存在大量的纖維，可以促進腫瘤細胞的上皮間質轉化的發生。另外，結腸癌周圍有大量的變性纖維基質，與侵襲能力增強和預后不佳呈正相關。因此，p53發生錯義突變促進結腸癌侵襲能力增強的機制可能與形成復雜的囊性結構，獲得浸潤能力以及誘導形成纖維基質形成相關。

2.5 p53 突變與炎癥信號通路激活

大量的流行病學和基因組學研究證實，炎癥反應會促進結腸癌的發生和發展，提示炎癥可能是結腸癌治療的一個潛在靶點。在腫瘤微環境中，有大量的巨噬細胞浸潤和激活，這些巨噬細胞被稱為腫瘤相關的巨噬細胞，表達CSF-1 和CCL2，而CSF-1 和CCL2 可能與腫瘤的侵襲和浸潤有關[17]。另外，在化學刺激誘導的小鼠結腸炎-結腸癌模型中[18]，巨噬細胞會釋放大量的細胞因子刺激腫瘤細胞、激活NF-κB 和Stat3 信號通路。但是，NF-κB 信號通路在腫瘤細胞中激活的機制仍然沒有詳細闡明。研究發現，p53 錯義突變可能在結腸癌中NF-κB信號通路的激活起著重要的作用。例如，當p53 發生錯義突變丟失其野生型的功能時，會加速化學刺激誘導結腸癌的發生和發展，以及上皮間質轉化增加[19]。其機制可能與Trp53功能障礙時，抑制閉合蛋白和密封蛋白的表達，導致上皮的屏障功能障礙有關。而細菌的產物，例如脂多糖，會滲透進入結腸的固有層，導致結腸內固有巨噬細胞的激活，進一步導致NF-κB信號通路在腫瘤細胞和間質細胞的激活[20]。

研究發現，當R127H 位點發生p53 突變時，與化學刺激誘導的潰瘍型結腸炎小鼠模型中腸道炎癥持續激活有關，這會進一步導致潰瘍相關的結腸癌的發生發展[21]。TNF-α 激活的NF-κB 信號通路會上調其下游靶基因在結腸上皮細胞內的表達。當p53 發生錯義突變時，NF-κB 結合下游靶基因啟動子的時間延長，導致炎癥細胞因子的持續釋放。在人類潰瘍相關的結腸癌中，TP53 突變是炎癥潰瘍中最常見的突變。因此，結腸潰瘍中發生p53 錯義突變可能是導致結腸癌發生發展的原因之一，其機制可能與促進炎癥反應有關。

Nakayama[22]等人通過使用來自ApcΔ716Trp53+/+，ApcΔ716Trp53Null，和ApcΔ716Trp53R270H/R270H小鼠的結腸腫瘤組織進行轉錄組基因測序，發現大約有350 個基因特異性的在ApcΔ716Trp53R270H/R270H小鼠的結腸腫瘤組織中表達上調。進一步通過生物信息學分析發現Wnt 信號通路和NF-κB信號通路在結腸癌組織中通過p53 突變R270 依賴性的方式激活。Nakayama 等人同樣發現啟動子結合能力在ApcΔ716Trp53R270H/R270H小鼠的接觸腫瘤中顯著增強，提示p53 突變打開了基因啟動子的染色質結構，導致Wnt 信號通路和NF-κB 信號通路激活。p53 突變引起的Wnt 信號通路和NF-κB信號通路激活可能會維持腫瘤細胞的干細胞特性或未分化狀態。

3 小結

深入研究結腸癌發生、發展的病理生理機制，對尋找新的潛在治療靶點具有極其重要的理論和現實意義，是目前結腸癌研究領域的熱點和難點問題。研究發現，促癌基因或抑癌基因表達和/或功能的異常在結腸癌的發生、發展以及化療藥物耐受和預后中起著重要的作用。隨著近年來包括腫瘤類器官的培養技術在內的生物技術和基因測序技術突飛猛進的發展，人們能夠應用多種敲基因或者轉基因小鼠模型來研究結腸癌發生發展的機制。通過這些小鼠模型，研究者們發現持續存在的p53 錯義突變，例如發生在R270H（人為R283H）位點的突變，在黏膜下層浸潤，包括上皮間質轉化、腫瘤轉移中起著極其重要的作用。當p53 錯義突變合并其他基因突變時，腫瘤的生長和轉移會更加厲害。盡管近年來報道了一些p53 導致癌癥發生發展的機制，但是p53 突變導致的染色質結構改變可能是導致促癌基因廣泛表達的最關鍵原因。在結腸癌細胞中，Apc 基因突變激活Wnt 信號通路，同時炎癥微環境也會導致NF-κB 信號通路的激活。另外，Wnt 信號通路和NF-κB 信號通路的相互作用會增強腫瘤細胞的干細胞特性和未分化狀態。因此，p53 錯義突變導致的染色質結構打開，導致Wnt 信號通路和NF-κB 信號通路處于持續激活狀態是導致結腸癌發生發展的重要機制。

重要的是，p53 錯義突變后在細胞核的聚集似乎是導致促癌基因表達和腫瘤發生的重要因素。盡管丟失野生型功能的p53 突變可能會導致p53穩定性增加，但有研究顯示p53 突變的穩定性以及在核內聚集的能力仍然受到細胞內信號的調控。因此，需要進一步研究p53 突變后的穩定性以及其在核內聚集調控的細胞內信號通路。目前對于結腸癌的治療一直未能找到十分有效的藥物，傳統的手術切除和化療藥物治療并沒有給結腸癌患者帶來明顯的獲益，因此，迫切需要尋找新的結腸癌潛在治療靶點，而這可以作為以后干預結腸癌的一個潛在治療靶點。