VCAN通過PI3K/AKT信號通路調(diào)控乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖

謝強 錢軍 張明亮 張立功 郭晨旭 許睿

[摘要] 目的 探討多能蛋白聚糖（VCAN）通過PI3K/AKT信號通路對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖的影響。 方法 利用Western Blot和qRT-PCR檢測VCAN在正常人乳腺細(xì)胞MCF-10A和三株乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。選取VCAN高表達(dá)細(xì)胞株MDA-MB-231為實驗對象，實驗分組為NC組、siRNA1-VCAN組和siRNA2-VCAN組。采用MTT法及克隆形成法檢測轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細(xì)胞增殖變化。Western Blot檢測p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K的蛋白相對表達(dá)水平。 結(jié)果 與正常人乳腺細(xì)胞相比，VCAN在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)量顯著上升（P<0.05）。下調(diào)VCAN表達(dá)量，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖顯著被抑制（P<0.05）。同時，下調(diào)VCAN表達(dá)量，p-AKT、p-PI3K蛋白水平顯著下降（P<0.05）。 結(jié)論 VCAN在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，可能通過 PI3K/AKT 信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖能力。

[關(guān)鍵詞] VCAN;乳腺癌;細(xì)胞增殖;PI3K/AKT

[中圖分類號] R730.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）36-0032-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of versican（VCAN） on the proliferation of breast cancer cells MDA-MB-231 through the PI3K/AKT signaling pathway. Methods Western Blot and qRT-PCR were used to detect the expression level of VCAN in normal human breast cells MCF-10A and three breast cancer cells. The VCAN high-expressing cell line MDA-MB-231 was selected as the experimental object， a nd they were divided into the NC group， siRNA1-VCAN group， and siRNA2-VCAN group. The MTT method and clone formation method were used to detect the proliferation of breast cancer cells after transfection. Western Blot was used to detect the relative protein expression levels of p-AKT， AKT， p-PI3K and PI3K. Results Compared with that of the normal human breast cells， the expression of VCAN in breast cancer cells increased significantly（P<0.05）. When the expression of VCAN was down-regulated， the proliferation of MDA-MB-231 cells was significantly inhibited（P<0.05）. At the same time， the expression of VCAN was downregulated， and the protein levels of p-AKT and p-PI3K decreased significantly（P<0.05）. Conclusion VCAN may regulate cell proliferation through PI3K/AKT signaling pathway in breast cancer MDA-MB-231 cells.

[Key words] VCAN; Breast cancer; Cell proliferation; PI3K/AKT

乳腺癌是全球癌癥最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率位居第一，嚴(yán)重威脅著全球女性的健康[1]。盡管采取了標(biāo)準(zhǔn)的治療策略，包括手術(shù)切除、放療或化療，其預(yù)后仍不理想[2-3]。因此，進(jìn)一步研究其發(fā)病機制對于乳腺癌的早期診斷和治療至關(guān)重要。多能蛋白聚糖（Versican，VCAN）是一種大型聚集性硫酸軟骨素蛋白多糖，是聚集蛋白聚糖家族的成員。該蛋白參與細(xì)胞黏附、增殖、遷移和血管生成，并在組織形態(tài)發(fā)生和維持中起關(guān)鍵作用。VCAN是重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，已鑒定出四種VCAN亞型。VCAN表達(dá)異常已在多種腫瘤中報道，如胃癌[4]、胰腺癌[5]、卵巢癌[6]和膀胱癌[7]，并與不良后果相關(guān)。先前的研究表明，VCAN可改善腫瘤細(xì)胞的存活、生長[8]、遷移[9]、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移。PI3K/AKT（Phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B）信號通路是細(xì)胞內(nèi)最重要的信號通路之一，在促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成，抵抗化療并產(chǎn)生耐藥性等方面起到重要的作用[10]。已有文獻(xiàn)報道VCAN可能影響膀胱癌的預(yù)后，富集分析發(fā)現(xiàn)其可能通過PI3K/AKT信號通路影響膀胱癌預(yù)后[7]。同時，在胃癌中也發(fā)現(xiàn)VCAN通過PI3K/AKT信號通路影響胃癌的預(yù)后。然而，目前關(guān)于VCAN在乳腺癌中PI3K/AKT的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究以乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231為研究對象，特異性地敲低VCAN表達(dá)，觀察VCAN是否影響乳腺癌細(xì)胞增殖，并進(jìn)一步探討其作用機制，為乳腺癌的臨床治療提供一定幫助?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-10A正常人乳腺細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7、SKBr3購于中科院細(xì)胞研究所。MCF-10A細(xì)胞、MDA-MB-231、MCF-7、SKBr3細(xì)胞采用RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。四種細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。在37℃、5% CO2、95%濕度條件下的培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞長至70%融合率時，進(jìn)行消化傳代。

1.2 主要試劑

siRNA、NC均購于上吉瑪制藥技術(shù)有限公司， RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司，胰蛋白酶購自美國Hyclone公司。Trizol和Lipofectamin2000試劑盒購于美國Invitrogen公司， cDNA試劑盒及SYBR Green試劑盒購于北京全式金公司。一抗（VCAN、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K、GAPDH）購于武漢三鷹生物科技有限公司，二抗購于中國Affinity公司。四甲基偶氮唑鹽（MTT）購于Biofroxx公司。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到70%時，按照說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，實驗分組為NC組（Lip2000和NC序列）、siRNA1-VCAN組（Lip2000和siRNA1-VCAN序列）和siRNA2-VCAN組（Lip2000和siRNA2-VCAN序列）。siRNA1-VCAN序列為5'-GGGAGUUCUUCGAUUCCAA-3';siRNA2-VCAN序列為5'-GAGGCUGGAACUGUUAUUA-3'。

1.4 實時熒光定量PCR檢測 mRNA 表達(dá)

采用Trizol提取細(xì)胞總RNA。將提取的總 RNA 按 RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（cDNA合成試劑盒）說明操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，總 RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。合成的cDNA按照SYBR Green試劑盒說明書通過PCR儀進(jìn)行擴增檢測，以GAPDH為內(nèi)參。最終Ct值采用 2-ΔΔCt方法分析。采用兩步PCR擴增標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行實時熒光定量PCR：步驟1： 預(yù)變性（95℃，30 s） ;步驟2： PCR反應(yīng)（95℃ 5 s，60℃ 30 s） ，共40個循環(huán)。所有試驗均重復(fù)3次。VCAN引物序列F： 5'-CCACGCTTCCTATGTGA-3'，R：5'-TTTCCCACTTTGACTTTATGT-3'。GAPDH引物序列F：5'-TCTCTC-CTCCTCCTGTTCG-3'，R：5'-GCGCCCAATAG-GACCAAATC-3'。

1.5 細(xì)胞活力檢測

細(xì)胞以5×104濃度接種于96孔板，每組4個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h。在對應(yīng)的時間點加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，加入DMSO溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm測定吸光度并繪制生長曲線。

1.6 克隆形成法檢測細(xì)胞增殖能力

乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231經(jīng)轉(zhuǎn)染干擾序列處理48 h，6孔板中每孔接種1500個細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d至克隆形成，除去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，用5%多聚甲醛固定20 min，5%結(jié)晶紫染色室溫孵育20 min，用雙蒸水洗滌2次。室溫干燥，觀察克隆形成情況，大約200個細(xì)胞集落為一個克隆。

1.7 Western Blot法檢測PI3K、AKT相關(guān)蛋白表達(dá)水平

使用細(xì)胞裂解液將MDA-MB-231細(xì)胞裂解過夜。隨后在4℃、14 000 g 離心30 min，收集上清液。BCA法測量蛋白質(zhì)濃度。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并用 PVDF膜轉(zhuǎn)膜。將膜在含有5% BSA封閉液中封閉2 h，并分別與 VCAN（1∶1000）、p-PI3K（1∶1000）、PI3K （1∶1000）、AKT（1∶1000）、p-AKT（1∶1000）及GAPDH（1∶1000） 等一抗4℃ 搖床孵育過夜，洗膜后在室溫與二抗兔抗（1∶1000）孵育2 h。配置超敏ECL顯影液，在凝膠成像儀中對條帶進(jìn)行顯影。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS23.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間兩兩比較則采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VCAN在不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平。

通過Western Blot及qRT-PCR方法檢測VCAN在不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與人乳腺細(xì)胞上皮細(xì)胞MCF-10A相比，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7和SKBr3中的VCAN表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。MDA-MB-231細(xì)胞中的VCAN表達(dá)水平在乳腺癌細(xì)胞中最高，因此以MDA-MB-231細(xì)胞株作為實驗對象。見圖1。

2.2 Western Blot及qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中VCAN的表達(dá)水平

Western Blot（圖2A）和qRT-PCR（圖2C）結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)染后，siRNA1-VCAN組和siRNA2-VCAN組的mRNA及蛋白表達(dá)量，與NC組相比下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 MTT檢測轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞的增殖作用

MTT結(jié)果顯示，敲低VCAN表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長受到顯著抑制。培養(yǎng)48 h和72 h時siRNA1-VCAN組、siRNA2-VCAN組與NC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明VCAN表達(dá)下降可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231體外增殖的能力。見封三圖1A。

2.4 克隆形成實驗

siRNA1-VCAN組和siRNA2-VCAN組的細(xì)胞克隆形成能力與NC組相比下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明VCAN表達(dá)下降可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖。見封三圖1B。

2.5 沉默VCAN對PI3K/AKT信號通路的影響

Western Blot實驗結(jié)果顯示，敲除VCAN表達(dá)水平后，與NC組比較，siRNA1-VCAN組與siRNA2-VCAN組的AKT、PI3K蛋白水平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），p-AKT、p-PI3K蛋白水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明沉默VCAN表達(dá)水平后，PI3K/AKT信號通路顯著抑制。見圖3。

3 討論

乳腺癌是全世界三種最常見的癌癥之一。早期乳腺癌被認(rèn)為可能是可治愈的[11]。雖然近年來乳腺癌研究取得了巨大進(jìn)展，但乳腺癌仍是一個主要的健康問題[12]。當(dāng)前的治療策略是有限的，并與許多副作用相關(guān)。因此，需要尋找強大而新穎的治療靶點來遏制乳腺癌的發(fā)病率不斷上升[13]。

VCAN是一種蛋白質(zhì)編碼基因。與VCAN相關(guān)的疾病包括相關(guān)的玻璃體視網(wǎng)膜病變和Wagner綜合征。有研究表明[14]，VCAN通過miR-124調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞的增殖。同時，VCAN也被證明參與腎癌增殖、轉(zhuǎn)移過程[15]。以上研究表明，VCAN在腫瘤的增殖過程中起著至關(guān)重要的作用。PI3K/AKT信號通路參與乳腺癌細(xì)胞的增殖、分化和遷移[16]。該通路一方面調(diào)控細(xì)胞增殖和分裂，另一方面控制細(xì)胞凋亡。目前，PI3K/AKT通路的研究主要集中于肝癌[17]、結(jié)腸癌[18]、卵巢癌[19]、胃癌[20]等方面，其尚未見VCAN基因在乳腺癌中的報道。部分研究報道，VCAN通過PI3K/AKT通路影響膀胱癌和胃癌預(yù)后。然而其在乳腺癌中的作用尚未報道。因此，本研究準(zhǔn)備探討VCAN與PI3K/AK通路在乳腺癌中的關(guān)系。

在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，沉默了VCAN的表達(dá)量，可以抑制AKT磷酸化的水平，從而影響PI3K/AKT通路的激活。因此，VCAN可能通過PI3K/AKT通路影響乳腺癌細(xì)胞的增殖。本研究通過Western Blot和qRT-PCR方法發(fā)現(xiàn)VCAN在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)量上升。說明VCAN在乳腺癌細(xì)胞中可能是一個癌基因。并根據(jù)細(xì)胞株的表達(dá)情況以VCAN高表達(dá)細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞為研究對象，敲低VCAN表達(dá)水平，通過克隆形成實驗和MTT實驗發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖能力受到顯著抑制。PI3Ks是由不同基因編碼的調(diào)控和催化亞基組成的異二聚類脂質(zhì)激酶。AKT是PI3K的下游效應(yīng)因子，調(diào)控許多生物學(xué)過程，包括增殖、凋亡和生長。乳腺癌中也有PI3K/AKT通路異常激活的報道[21]。敲低VCAN，p-AKT、p-PI3K蛋白水平顯著下降。AKT、PI3K蛋白是PI3K/AKT信號通路的關(guān)鍵分子，而其磷酸化水平代表著PI3K/AKT信號通路。因此，VCAN的敲低能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的AKT和PI3K的激活，進(jìn)而抑制PI3K/AKT信號通路。

綜上所述，敲低VCAN能夠通過抑制PI3K/AKT信號通路從而抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力，提示VCAN在乳腺癌的增殖中起到關(guān)鍵作用，其在今后可能成為一個臨床治療靶點。

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