孟魯司特對大鼠小腸缺血再灌注傷腎臟CysLTsR1表達及腎功能的影響

徐木生 何劉 吳深寶 馮萍 徐小宏 陳貴平

[摘要] 目的 研究孟魯司特對大鼠小腸缺血再灌注傷（IIR）腎臟CysLTsR1表達及腎功能的影響。 方法 30只成年雄性wistar大鼠隨機分為對照組、缺血再灌注組（模型組）和孟魯司特組，每組各10只。采用鉗閉大鼠腸系膜上動脈建立IIR模型。建模3 h后觀察各腎組織病理學形態并評分;免疫組化、Western blot和RT-PCR法檢測腎組織CysLTR1和中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白表達水平;生化分析儀檢測血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）。 結果 模型組與對照組比較腎組織損傷嚴重，病理損傷Paller評分明顯增高[（408.9±17.3）分 vs （110.3±10.0）分]，CysLTR1 mRNA水平顯著升高[（3.60±0.84） vs （1.93±0.11）]，CysLTR1蛋白表達顯著升高，血清BUN和Cr值均顯著升高[（21.82±2.39） vs （6.25±0.56）;（57.85±8.18） vs （25.55±2.92）]，NAGL表達顯著升高[（677.67±6.03） vs （576.67±12.66）]，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組相比較，孟魯司特組病理損傷Paller評分顯著低于模型組[（323.4±14.9）分 vs （408.9±17.3）分];CysLTR1 mRNA水平顯著降低[（2.80±0.36） vs （3.60±0.84）];CysLTR1蛋白表達顯著降低（P<0.01）;血清BUN和Cr均顯著降低[（13.50±1.31） vs （21.82±2.39）;（30.85±3.94） vs （57.85±8.18）]，差異有統計學意義（P<0.01），NAGL表達降低[（645.00±38.20） vs （677.67±6.03）]，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 孟魯司特可減輕小腸缺血再灌注腎損傷，其機制與其抑制腎組織CysLTR1的活化有關。

[關鍵詞] 半胱氨酰白三烯受體1;孟魯司特;小腸缺血再灌注;腎功能;中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白

[中圖分類號] R574? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）32-0040-05

[Abstract] Objective To study the effects of montelukast on the expression of CysLTsR1 and renal function in rats with small intestinal ischemia-reperfusion（IIR） injury. Methods Thirty adult male wistar rats were randomly divided into the control group and the ischemia-reperfusion group （model group）， and the montelukast group with ten rats in each group. The IIR model was established by clamping the superior mesenteric artery in rats. After modeling for 3 hours， the pathological morphology of each kidney tissue was observed and scored. The expression levels of CysLTR1 and neutrophil gelatinase-related lipocalin in kidney tissue were detected by immunohistochemistry， Western blot， and RT-PCR methods. The serum urea nitrogen（BUN） and creatinine（Cr） were detected by biochemical analyzer. Results The kidney tissue damage in the model group was more severe than in the control group. The Paller score of pathological injury and the level of CysLTR1 mRNA in the model group was significantly high than that in the control group（[408.9±17.3] points vs. [110.3±10.0] points）， （[3.60±0.84] vs. [1.93±0.11]）. The CysLTR1 protein expression of the model group was significantly increased. The serum BUN， Cr， and NAGL expression of the observation group were significantly higher than those of the control group （[21.82±2.39] vs. [6.25±0.56]; [57.85±8.18] vs. [25.55±2.92]）; （[677.67±6.03] vs. [576.67±12.66]）， and the difference was statistically significant（P<0.01）. The Paller score of pathological damage and CysLTR1 mRNA level in the montelukast group was significantly lower than that in the model group （[323.4±14.9] points vs. [408.9±17.3] points）; （[2.80±0.36] vs. [3.60±0.84]）. The CysLTR1 protein expression of the montelukast group was significantly lower than that of the model group（P<0.01）. The serum BUN， Cr， and NAGL expression of the montelukast group were significantly lower than those of the model group（[13.50±1.31] vs. [21.82±2.39]; [30.85±3.94] vs. [57.85±8.18]）; （[645.00±38.20] vs. [677.67±6.03]）， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion Montelukast can alleviate small intestinal ischemia-reperfusion kidney injury. Its mechanism is related to its inhibition of renal activation of CysLTR1.

[Key words] Cysteinyl leukotriene receptor 1; Montelukast; Small intestine ischemia-reperfusion; Renal function; Neutrophil gelatinase-associated lipocalin

腸缺血再灌注傷（Intestinal ischemia reperfusion，IIR）可導致嚴重創傷、休克、腸系膜動脈血栓形成、絞窄性腸梗阻和小腸移植等常見嚴重并發癥，也可導致腎臟損傷在內的遠隔臟器損傷，死亡率高達60%～80%[1]，研究表明，核心病理生理變化是IIR時腸道黏膜屏障損傷和血管通透性增加促發腸道菌群移位和機體嚴重炎癥級聯反應，大量炎癥細胞因子及移位菌群等有害物質通過血液循環損傷肺臟、肝臟和腎臟等遠隔臟器，嚴重者可致多器官功能障礙綜合征（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[2]。腎臟是IIR損傷的一個重要靶器官，臨床處理非常棘手，缺乏有效的治療手段[3]。腎損傷中毒時中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（Neutropil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）可早期大量表達于近端小管上皮細胞，參與炎癥反應和調節細胞增殖凋亡，可作為急性腎損傷的早期診斷標志物之一[4]。半胱氨酰白三烯（Cysteinyl leukotrienes，CysLTs）是強有力的促炎介質，其配體半胱氨酰白三烯受體1（Cysteinyl leukotriene receptor 1，CysLTR1）廣泛表達于炎癥細胞和結構細胞表面，在IIR損傷中起重要作用。課題組前期研究結果顯示，CysLTR1特異性受體拮抗劑孟魯司特對IIR模型鼠腸損傷具有保護作用[5-7]。本研究將進一步探討IIR模型鼠腎損傷CysLTR1的表達及孟魯司特的保護作用，并探討其可能的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物? 30只雄性wistar大鼠，體重（320±30）g。購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，合格證號：SCXK-（軍）2007-004。

1.1.2 試劑和儀器? 孟魯司特片（杭州默沙東制藥有限公司，批號：110705）;CysLTR1多克隆抗體（Abcam公司，貨號：ab95492）;NAGL多克隆抗體（Abcam公司，貨號：ab137685）;SP免疫組化染色試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）;高純總RNA快速提取試劑盒（Generay公司）;SYBR Green PCR試劑盒和逆轉錄試劑盒（Thermo公司）;全自動體生化分析儀（日本日立公司6500型）。

1.2 方法

1.2.1 造模與給藥? 采用隨機數字表法將大鼠隨機分為對照組、缺血再灌注組（模型組）、孟魯司特組，每組各10只。模型組和孟魯司特組參照文獻建立腸缺血再灌注模型鼠[6]，具體如下：建模前各組大鼠禁食12 h，不禁水。孟魯司特組術前1 h按大鼠2 mg/kg孟魯司特灌胃給藥;對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，腹部皮膚常規備皮消毒，取中腹部正中切口長約4 cm，分離腸系膜上動脈（Superior mesenteric artery，SMA）起始部，予無創血管夾夾閉，使之完全阻斷血流45 min后松開，再灌注2 h，腸缺血再灌注模型制備成功。夾閉期間斷腹腔內注射5 mL生理鹽水，以預防松開動脈夾后出現一過性低血容量反應，對照組除不鉗夾SMA外其余操作相同。各組關閉腹腔后放回鼠籠觀察，自由進食、飲水。再灌注3 h后大鼠再次麻醉進腹，腹主動脈采血后切除大鼠腎臟用于HE染色、RT-PCR、免疫組化和Western blot檢測。

1.2.2 大鼠腎臟病理變化及病理損傷評分? 腎臟組織經10%福爾馬林固定、包埋、切片后HE染色，光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理形態學的變化，每份樣本均由兩位有經驗的病理醫師獨立病理Paller's評分[7]：每個高倍鏡視野下隨機選擇10個病變的腎小管，按100個腎小管計分，評分標準：腎小管明顯擴張、細胞扁平1分;刷狀緣損傷1分，脫落2分;管型2分;腎小管管腔內有脫落或壞死細胞（未成管型或細胞碎片）計1分。

1.2.3 大鼠血清標本采集及生化指標檢測? 抽取大鼠腹主動脈血液5 mL，2000 r/min離心10 min取血清，采用全自動生化分析儀測定血清尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐（Crea，Cr）含量。

1.2.4 大鼠腎臟免疫組化檢測CysLTR1蛋白和NGAL蛋白表達? 大鼠腎臟石蠟切片經二甲苯脫蠟、不同濃度酒精水化和枸櫞酸緩沖液抗原修復;分別滴加一抗多克隆CysLTR1抗體（1∶100）和多克隆NGAL抗體（1∶500），4℃過夜;二抗常溫孵育30 min;隨后DAB試劑染色、蘇木素復染及中性樹膠封片。顯微鏡下每張切片隨機選取4個高倍鏡觀察定位，利用Image J計算平均光密度值。

1.2.5 RT-PCR法測定腎臟組織中CysLTR1 mRNA水平? 切取大鼠腎臟組織并迅速放至-80℃冰箱凍存待檢。Trizol離心柱法提取組織總RNA，M-MLV逆轉錄酶進行逆轉錄，采用熒光定量PCR擴增CysLTR1，以GAPDH為內參，根據Genbank設計引物，由上海生工生物技術公司合成（表1）。熒光定量PCR儀設置參數：95℃預變性l min;95℃變性15 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，讀板，共40個循環;融解曲線。得到每個樣品的Ct值，計算每個樣品目的基因的相對表達量2-△△Ct。△△Ct=（待測組目的基因平均Ct值-待測組內參基因平均Ct值）-（對照組目的基因平均Ct值-對照組內參基因平均Ct值）。

1.2.6 Western-blot檢測大鼠腎臟組織CysLTR1蛋白表達? 冰上研碎大鼠腎組織100 mg后加入RIPA裂解液，超聲破碎后4℃，12000 r/min離心15 min，取上清液，測定蛋白濃度，制定標準蛋白曲線，8%SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，然后將蛋白轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，加CysLTR1抗體（1：500）孵育4℃過夜，含吐溫緩沖液（PBST）洗脫一抗（10 min×2次），加1：1000稀釋HRP標記的二抗，孵育1 h后PBST洗脫二抗（10 min×3次），滴加顯影液（NBT/BCTP）顯色，發光壓片，以GAPDH作為內參照，Image J分析測定灰度值，結果用靶蛋白/GAPDH比值表示蛋白表達的相對水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS17.0統計學軟件進行分析處理，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，方差齊時采用t檢驗，方差不齊時采用校正t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎臟組織的病理學變化

光鏡下對照組大鼠腎小球腎小管清晰可見，未見明顯的形態學改變;模型組大鼠腎臟可見不同程度的腎小球萎縮變形，腎間質炎細胞浸潤，腎小管上皮細胞腫脹空泡變性，管腔變大，甚至腎小管片狀出血壞死;孟魯斯特組也存在上述病理改變，但較模型組明顯改善。Paller評分結果顯示：模型組顯著高于對照組[（408.9±17.3）分 vs （110.3±10.0）分]，差異有顯著統計學意義（P<0.01）;孟魯司特組顯著低于模型組[（323.4±14.9）分 vs （408.9±17.3）分]，差異有顯著統計學意義（P<0.01）。見封三圖3。

2.2 各組大鼠血尿素氮和血肌酐的水平比較

再灌注后3 h，模型組大鼠血清中BUN、Cr含量顯著高于對照組，差異有顯著統計學意義（P<0.01）;孟魯司特組大鼠血清中BUN和Cr的含量顯著低于模型組，差異有顯著統計學意義（P<0.01）。見表2。

2.3 免疫組化各組大鼠腎臟組織CysLTR1和NGAL的表達

與對照組比較，模型組CysLTR1和NGAL的表達均顯著增加，差異有顯著統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，孟魯司特組CysLTR1表達顯著降低，差異有顯著統計學意義（P<0.01）;NAGL的表達降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見封三圖4、表3。

2.4 各組腎臟組織中CysLTR1mRNA表達

與對照組相比，模型組CysLTR1 mRNA表達明顯升高[（3.60±0.84） vs （1.93±0.11）]，兩組比較，差異有顯著統計學意義（P<0.01）;而與模型組比較，孟魯斯特組CysLTR1 mRNA表達降低[（2.80±0.36） vs （3.60±0.84）]，兩組比較，差異有顯著統計學意義（P<0.01）。

2.5 Western blot觀察各組大鼠腎臟組織CysLTR1蛋白表達

各組腎臟組織CysLTR1表達均有陽性條帶，位于44 kD。與對照組比較，模型組CysLTR1表達明顯增加，兩組比較，差異有顯著統計學意義（P<0.01）;孟魯斯特組與模型組比較CysLTR1表達明顯降低（P<0.01）。見圖1。

3 討論

腸缺血再灌注傷致遠隔器官損傷分子機制尚未完全闡明，可能為腸缺血再灌注時活化的血小板和血管收縮介質誘發腸黏膜細胞鈣超載和大量氧自由基產生，加劇腸黏膜屏障損傷，腸道細菌和內毒素等有害物質移位至遠隔器官[8-10]。腎臟血流動力學具有高灌注和高濾過特性，因此腎臟成為IIR的常見重要靶器官，嚴重腎臟損傷可致腎功能衰竭而危及生命。半胱氨酰白三烯（CysLTs）包括LTC4、LTD4和LTE4三種亞型，當內臟免疫細胞接觸過敏原、炎癥細胞因子刺激后，觸發細胞內和細胞外液中Ca2+動員，導致胞漿磷脂酶A2（cPLA2）及其他類型PLA2酶的激活，這些酶從膜磷脂中分離出花生四烯酸，然后花生四烯酸通過5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LO）在5-LO活化蛋白（5-lipoxygenase-activating protein，FLAP）作用下產生CysLTs[11]。CysLTs除可促進支氣管平滑肌收縮外，還主要為促炎因子，與急性或慢性炎癥反應有關，主要來源于免疫細胞外，另外內皮細胞吸收白細胞釋放的LTA4后，經微粒體GST-2和γ-谷氨酰轉肽酶作用也可分泌CysLTs;CysLTsR根據對經典拮抗劑敏感性不同將CysLTs受體主要分為CysLTsR1和CysLTsR2兩種亞型。正常人體多種組織細胞如小腸、肝臟和腎臟等器官也低表達CysLTR1，并發揮一定正常的生理功能[12-14]。研究表明，CysLTsR1主要存在于肺部、支氣管、平滑肌等組織嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞等多種炎癥細胞，主要識別LTC4、LTD4和LTE4，其中與LTD4的親和力最強;而CysLTsR2主要分布在粒細胞。CysLTs通過CysLTs/CysLTsR途徑與其他炎癥介質相互作用誘發炎癥級聯放大，增加血管通透性和促進黏液分泌，促進大量炎癥細胞聚集[15]。NGAL是由中性粒細胞和某些上皮細胞如腎小管所表達的微量蛋白，缺血性或腎毒性腎損傷時，NGAL在腎臟大量表達，并被釋放到尿液和血漿，一般在腎損傷發生后2 h內升高，為早期且敏感的腎損傷生物標志物。本課題組前期研究證實，腸缺血再灌注損傷時小腸組織的CysLTR1表達水平與小腸組織病理損傷程度關系密切，孟魯司特減輕腸缺血再灌注引起的小腸損傷[5]。為此，本研究進一步研究發現，正常對照組腎臟組織中NGAL和CysLTs輕微表達;當小腸缺血再灌注時腎功能受損嚴重，腎間質大量炎癥細胞浸潤、部分腎小球萎縮變形、腎小管細胞水腫甚至出血，腎臟組織CysLTR1蛋白和CysLTR1 mRNA水平表達均明顯升高，免疫組化顯示CysLTR1主要表達于腎小球和腎小管，而相對應腎小球和腎小管病理損傷嚴重，NGAL表達量顯著增加，表明腎臟組織CysLTsR1蛋白的表達水平和腎臟組織病理損傷及腎臟NGAL水平呈正相關，腎臟組織CysLTsR1蛋白表達水平越高，腎臟組織損傷越嚴重。孟魯司特作為選擇性可逆的CysLT1受體拮抗劑具有抗氧化抗炎作用，臨床上常應用于哮喘的維持治療、緩解季節性過敏癥狀[16-17]。本研究結果顯示，與模型組相比孟魯司特組腎組織CysLTR1和NGAL表達顯著下降，血清BUN和Cr含量降低，顯著改善腎功能，提示孟魯司特對IIR模型鼠腎損傷具有保護作用，可能與孟魯司特抑制CysLTs/CysLTsR途徑中性粒細胞浸潤、抑制分子黏附和脂質過氧化有關[18-20]。

綜上所述，孟魯司特在IIR模型鼠腎損傷中起保護作用;保護機制是通過抑制腎組織中CysLTsR1表達，抑制CysLTs/CysLTsR途徑而減少炎癥介質的釋放。因此，靶向CysLTsR1有望成為IIR腎損傷新的治療手段，值得進一步研究。

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（收稿日期：2020-09-17）