葉面噴施外源ABA對胡椒抗寒生理生化及ABA信號轉導相關基因的影響

伍寶朵　崔鑫　胡麗松　范睿　朱春梅　楊建峰　郝朝運

摘要：【目的】篩選出能提高胡椒抗寒性的脫落酸（ABA）適宜濃度，明確低溫脅迫條件下外施適宜濃度ABA對胡椒葉片ABA信號轉導相關基因SnRK2和PYL表達的影響，為生產上提高胡椒抗寒技術及揭示ABA信號在胡椒抗寒中的作用機理提供依據。【方法】以熱引1號胡椒為試驗材料，通過葉面噴施0（CK）、25（T1）、50（T2）、75（T3）、100（T4）mg/L ABA及4 ℃低溫脅迫處理，測定各處理胡椒葉片葉綠素熒光參數、抗氧化酶活性（POD、CAT和SOD）、H2O2和MDA含量。在篩選出適宜ABA噴施濃度的基礎上，進一步運用實時熒光定量PCR分析ABA信號轉導相關基因的表達情況。【結果】低溫脅迫后，不同濃度ABA處理的胡椒POD、CAT和SOD活性與CK相比均顯著上升（P<0.05，下同），其中T2處理的POD活性升高最顯著，T3處理的CAT和SOD活性升高最顯著;隨著ABA處理濃度的升高，H2O2和MDA含量呈先下降后上升的變化趨勢，以T3處理含量最低，即一定濃度外源ABA處理對胡椒抗寒生理發揮積極作用。低溫脅迫0 d時，不同ABA濃度處理的胡椒Fv/Fm和Fv/Fo無顯著變化;低溫脅迫4d時，其Fv/Fm和Fv/Fo均顯著降低，但T3處理緩解Fv/Fm和Fv/Fo下降效果顯著，即ABA預處理能夠在一定程度上緩解低溫對胡椒光系統潛在活性的抑制。低溫脅迫0 d時，不同ABA濃度處理胡椒的qP和Yield無顯著變化，但qN隨著ABA處理濃度的升高明顯下降，即正常生長條件下，外施不同濃度ABA對胡椒葉片的qP和Yield無影響，但會減弱胡椒的光保護能力;低溫脅迫4 d時，不同ABA濃度處理的胡椒葉片qP、qN和Yield均有不同程度的下降，隨著ABA處理濃度的升高，qN呈現下降、上升再下降的變化趨勢，qP呈先下降后上升的變化趨勢，T3處理成為轉折點，即在低溫脅迫下外源ABA能夠提高胡椒的光保護能力，其中T3處理效果相對較好。低溫脅迫條件下，ABA預處理可誘導ABA信號轉導相關基因SnRK2和PYL提前并高表達。【結論】外源ABA通過提高胡椒抗氧化酶活性、降低H2O2和MDA含量及緩解低溫對其光系統活性的傷害，從而提高胡椒抵抗低溫脅迫的能力。外源ABA還能誘導胡椒ABA信號轉導相關基因表達，啟動和引發植株固有抗凍性基因的表達，進而提高其耐凍性。

關鍵詞： 胡椒;抗寒性;低溫脅迫;ABA;生理生化;ABA信號轉導相關基因

中圖分類號： S311 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）11-2764-09

Effects of exogenous foliar spraying ABA on genes related to cold resistance physiology， biochemistry and ABA signal transduction of black pepper

WU Bao-duo1， 2， 3， CUI Xin4， HU Li-song1， 2， 3， FAN Rui1， 2， 3， ZHU Chun-mei4，

YANG Jian-feng1， 2， 3， HAO Chao-yun1， 2， 3*

（1Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan ?571533， China; 2Ministry of Agriculture and Rural Affairs Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China; 3Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China; 4Tropical Crops College， Yunnan Agricultural University， Puer， Yunnan 665000， China）

Abstract：【Objective】The optimal abscisic acid（ABA） concentration to improve the cold resistance for black pepper was screened，and the expression changes of SnRK2 and PYL genes of ABA signal transduction related genes in black pepper leaves under low temperature stress were clarified， which could provide basis for further research on the cold resistance mechanism of black pepper and function of ABA signal in cold resistance of black pepper. 【Method】Piper nigrum cv. Reyin1 leaves were sprayed with 0（CK）， 25（T1）， 50（T2）， 75（T3）， 100（T4） mg/L ABA. After 4 ℃ low temperature stress， detected the chlorophyll fluorescence parameters， antioxidant enzyme activities（POD， CAT and SOD）， H2O2 and MDA content. Base on the suitable ABA concentration， the expression of ABA transduction related genes was further analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The POD， CAT， SOD activities of black pepper were significantly increased under low temperature stress compared with CK（P<0.05， the same below）. Furthermore， the POD activity increased the most in T2 treatment， and the CAT and SOD activities in T3 treatment increased the most. With the increase of ABA treatment concentration， the contents of H2O2 and MDA first decreased and then increased. And the value was the lowest in T3 treatment. The results declared that certain concentration of exogenous ABA treatment played a positive role in black pepper resistant to cold stress. Fv/Fm and Fv/Fo values treated by different ABA concentrations did not change significantly under low temperature stress of 0 d， while the values decreased significantly under low temperature stress of 4 d. However， T3 treatment had a significant effect in alleviating the decline of Fv/Fm and Fv/Fo values. The results indicated that ABA pretreated black pepper could alleviate the inhibition on the light system potential activity. Under low temperature stress of 0 d， the qP and yield values treated with different ABA concentrations did not change significantly， but the qN value decreased significantly with the increase of ABA concentration. It showed that different ABA concentrations had no effect on the qP and Yield values of black pepper under normal growth conditions， but the light protection ability was weakened. Under low temperature stress of 4 d， the qP， qN and Yield value were also decreased. With the increase of concentration of ABA treatment， qN value presented a trend of decreased， increased and then decreased， and qP value showed a trend of decreased and then increased. The turning point was T3 treatment. These results showed that exoge-nous ABA under low temperature could improve the light protection ability of black pepper， and T3 treatment performed the best. Under low temperature stress， ABA pretreatment could induce the early and high expression of SnRK2 and PYL genes. 【Conclusion】Exogenous ABA enhances pepper resistance to low-temperature stress moths by increasing pepper antioxidant enzyme activity， reducing H2O2 and MDA contents， and alleviating the damage of low temperature to its light system activity. The exogenous ABA can also induce the expression of pepper ABA signal transduction related genes， ini-tiate and trigger the expression of plant inherent antifreeze genes， and then improve its freezing resistance.

Key words： black pepper; cold resistance; low temperature stress; ABA; physiology and biochemistry; ABA signal transduction related genes

Foundation item： Hainan Natural Science Foundation（320QN346）; ?Basic Scientific Research Project of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（1630142017010）

0 引言

【研究意義】胡椒（Piper nigrum L.）原產印度，是世界上最重要的香辛料作物之一，具有較高的經濟價值。在我國，胡椒主要分布在海南、云南、廣東、廣西和福建等省（區）。據統計，2018年海南胡椒種植面積約2.63萬ha，年產量超過4萬t，占全國90%以上。隨著食品加工業及醫藥工業的發展，胡椒的食用和藥用價值不斷被深化拓展，市場需求量也日益增長。我國胡椒長期依靠進口滿足內需，供需矛盾突出，產業發展空間大。近年來，云南省大力發展胡椒產業，胡椒種植面積發展迅速（王燦等，2015;張春林等，2018）。我國主栽胡椒品種熱引1號胡椒屬于低溫敏感品種，遭受寒害會出現掉葉、斷枝現象，而熱區頻發的寒流等極端氣候給胡椒生產造成嚴重影響（蕭自位等，2017;伍寶朵等，2018b）。但胡椒是經濟效益較高的熱帶經濟作物，將種植面積擴大到高緯度和高海拔地區可促進農民脫貧致富。因此，加強胡椒抗寒研究對其高產穩產及產業規模擴大具有重要意義。【前人研究進展】脫落酸（Abscisic acid，ABA）是植物在逆境環境中生成的重要信號物質之一，被廣泛稱為脅迫激素或逆境激素，是誘導植物體內抗逆基因表達的第一信使，在調節植物體內物質平衡和誘導脅迫抗性方面發揮重要作用，在感受低溫脅迫信號及提高植物抗寒性中也起著重要作用（李艷軍，2005），即篩選適宜胡椒的ABA噴施濃度可為生產上提高胡椒抗寒性提供參考。田丹青等（2010）通過以50 mg/L ABA預處理低溫脅迫的蝴蝶蘭發現，外施ABA可提高蝴蝶蘭葉片抗氧化酶活性，減少膜脂過氧化產物積累，降低細胞膜透性，從而減輕低溫傷害。尹松松等（2016）篩選出適宜番茄抗冷性增強的ABA濃度為200 μL/mL，并指出ABA預處理可增加脅迫葉片內脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量，促進冷脅迫相關基因（SLCMYB1和LENLP4）的表達。此外，葉綠素熒光參數被抑制程度與逆境脅迫間呈正相關，可作為植物的抗逆指標（馮建燦等，2002）。ABA受體PYR/PYL/RCAR蛋白、負調控因子2C類蛋白磷酸酶（PP2C）和正調控因子SnRK2s被認為是ABA信號途徑的重要組件，其共同構成一個雙向負調控系統來調控ABA信號轉導及其下游反應。ABA信號誘發PYR/PYL/RCAR蛋白與PP2C相互作用，導致PP2C被抑制并激活SnRK2s，進而引發下游響應基因（ABF/AREB/ABI5和SLAC1等）被磷酸化或激活（Umezawa et al.，2010）。過量表達OsPYL3和OsPYL9可改善水稻的干旱和寒冷脅迫耐受性（Tian et al.，2015），而PYL-PP2C-SnRK2介導的ABA信號正向調控香蕉果實的成熟及耐寒、耐鹽和滲透脅迫（Hu et al.，2017）。低溫脅迫下，ABA可誘導、啟動和引發植物固有抗凍性基因的表達，提高植物耐凍性。Rubio等（2018）研究發現低溫和外施ABA均可誘導葡萄休眠芽CBF/DREB1轉錄因子表達增強，而ABA和低溫聯合處理致使CBF/DREB1轉錄因子表達量大于單獨處理之和，并顯著增強休眠芽抗寒性。綜上所述，外施ABA能改善植物的脅迫生理，并誘導抗凍性基因表達，提高植物抗寒性。【本研究切入點】目前，我國胡椒產區主要采用越冬前增施有機肥、在椒頭培土覆蓋，寒害發生前設防霜棚、防風障、放熏煙堆等措施進行防寒，以及寒害過后采取病害防治、施肥、補種等措施恢復生產，但這些措施實施效果有限，災后補救難以減少椒農損失。采用噴施ABA提高植物抗寒性已有相關報道，但外施ABA對胡椒抗寒性的影響及適宜噴施濃度等仍需深入探究。【擬解決的關鍵問題】研究不同濃度ABA對低溫脅迫下胡椒葉片表型變化和抗寒生理變化的影響，明確ABA處理下胡椒抗寒能力變化，篩選出適宜外施ABA濃度并分析外施ABA對ABA信號轉導相關基因表達的影響，以期為生產上提高胡椒抗寒性技術及揭示ABA信號在胡椒抗寒中的作用機理提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗在中國熱帶農業科學院香料飲料研究所進行，試驗胡椒品種為熱引1號扦插苗，來源于農業農村部萬寧胡椒種質資源圃。熱引1號扦插苗按照農業行業標準NY/T 360—1999《胡椒 插條苗》執行。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 試驗設計 于2018年5月選取健康和無機械損傷的胡椒插條在溫室沙床上培育，生根后選擇生長一致的植株移栽至直徑18 cm、高25 cm的育苗袋中，每袋2株，土壤為園土和枯枝落葉粉碎物以3∶1混勻配比而成。移栽成活3個月后移入人工培養室進行試驗處理。于同年11月在人工培養室中30 ℃/24 ℃（12 h/12 h）培養1周，生長穩定后開始進行ABA處理。設5個梯度濃度處理，分別為0（CK）、25（T1）、50（T2）、75（T3）、100 mg/L（T4）ABA溶液，每處理4株，3次重復。接50 mL/株的劑量將ABA溶液噴施在相應處理植株葉片正反兩面，直至滴水，多余溶液澆于盆內，每隔1 d噴施1次，共6 d。低溫脅迫處理4 d，低溫脅迫培養參數設置：溫度15 ℃/5 ℃，光照強度200 μmol/（m2·s），時間為12 h/12 h，相對濕度保持在70%左右。處理完成后，測量葉綠素熒光參數并取樣用于測定葉片生理生化指標。基因表達試驗采用篩選出的75 mg/L ABA溶液處理胡椒，以純水為對照，材料培養和ABA處理方法同上。ABA處理完成后，以5 ℃低溫脅迫72 h，光照強度為200 μmol/（m2·s），時間為12 h/12 h，相對濕度保持在70%左右。并于低溫脅迫0、4、8、24、48和72 h時分別取樣抽取RNA，用于驗證ABA信號傳導途徑中相關基因在低溫脅迫ABA處理胡椒中的表達情況。

1. 2. 2 測定項目及方法 測定低溫脅迫后各處理胡椒葉片的過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量及過氧化氫（H2O2）含量等生理生化指標，每處理3次重復，各指標采用南京建成生物技術有限公司試劑盒進行測定。采用Li-6400便攜式光合測定儀于低溫脅迫前和常溫恢復2 h測定各處理胡椒葉綠素熒光參數，光照強度為900 μmol/（m2·s），CO2濃度為400 μmol/mol，流速為500 μmol/s，每處理3次重復。在葉片光化學反應達穩態時，測得PSII光化學猝滅系數（qP）、非光化學猝滅系數（qN）和實際光能轉化效率（Yield）。用錫箔紙包被近枝頭端第一完全穩定葉進行暗處理過夜，測定初始熒光（Fo）和最大熒光（Fm）。參照Rohá?ek（2002）的研究方法計算最大可變熒光Fv=Fm-Fo，并由此得到最大光化學量子產量（Fv/Fm）和最大光能轉化潛力（Fv/Fo）

用于基因表達分析的樣品在預冷研缽中用液氮研磨至粉末狀，按試劑盒說明書提取RNA。采用TaKaRa試劑盒反轉錄合成cDNA。根據GenBank已公布的模式植物SnRK2和PYL基因序列，在胡椒EST數據庫（SRX708503）中進行BLASTn搜索，獲得與SnRK2和PYL基因序列同源的2個序列，即CL4161.Contig1_All和CL4292.Contig1_All。設計ORF特異性引物qABAs-F：5'-TTAGATGGAAGCAT GGCAC-3'、qABAs-R：5'-GAATGTAGCACGGAAG ACTG-3'和qABAp-F：5'-GTGAATGTGAAAACGG GTCT-3'、qABAp-R：5'-AGAAAAGGGAGGCAATA AAT-3'，分別用于檢測胡椒中SnRK2和PYL基因表達量。

實時熒光定量PCR檢測以胡椒管家基因Polyubiquitin 1為內參，qABAs和qABAp為目標基因引物。采用熒光定量PCR儀（Life Technologies Quant Studio 6 Flex）進行PCR擴增，反應體系10.0 μL，其中cDNA模板1.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 5.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，ddH2O補足至10.0 μL。每處理cDNA模板設3次重復，擴增程序為經典的2步法：95 ℃預變性2 min;95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，進行40個循環。采用2-△△Ct法計算不同處理樣品中目的基因的相對表達量。

1. 3 統計分析

使用Excel 2010整理試驗數據;運用SPSS 16.0進行方差分析，并以Excel 2010制圖。

2 結果與分析

2. 1 外源ABA處理對低溫脅迫下胡椒葉片的影響

觀察胡椒植株葉片表型（圖1）可發現，低溫脅迫下經ABA處理可提高熱引1號胡椒抗寒性。其中，CK和T4處理植株受害較重，部分葉片脫落，部分穩定葉明顯發黑，T1和T2處理植株部分葉片發黃，穩定葉邊緣及葉尖發黑，植株受害較輕，T3處理植株寒害表型不明顯。說明噴施一定濃度外源ABA可緩解胡椒寒害表型，且以75 mg/L ABA處理胡椒的寒害表型最輕。

2. 2 外源ABA處理對低溫脅迫下胡椒葉片H2O2含量的影響

低溫脅迫能造成細胞內活性氧積累，而活性氧積累是引起質膜損傷的重要因素。如圖2所示，低溫脅迫下，隨ABA濃度的增加胡椒葉片H2O2含量呈現先減少后增加的趨勢。其中，T3處理H2O2含量較CK顯著下降20.67%（P<0.05，下同）;T1、T2和T4處理的H2O2含量與CK相比有下降變化趨勢，分別下降10.98%、10.54%和8.11%，但無顯著差異（P>0.05，下同）;T1、T2和T4各處理間的H2O2含量也無顯著差異;T3處理H2O2含量低于T1、T2和T4處理，但無顯著差異，分別下降12.21%、11.33%和15.84%。以上結果說明低溫脅迫下，噴施低于100 mg/L的外源ABA可不同程度降低胡椒葉片中H2O2含量，保護質膜免受傷害，其中以75 mg/L ABA處理降低H2O2含量效果最顯著。

2. 3 外源ABA處理對低溫脅迫下胡椒葉片抗氧化酶活性的影響

POD、CAT和SOD是植物體內清除自由基的3種重要保護酶，其活性增強可作為植物抗寒性鑒定的標準（He et al.，2016）。由圖3可知，低溫脅迫后，適宜濃度ABA處理可提高胡椒葉片中POD、CAT和SOD活性。從圖3-A可看出，與CK相比，POD活性在T1處理無顯著變化，T2、T3和T4處理均顯著升高，分別升高162.78%、120.45%和17.40%，說明低溫脅迫下噴施25 mg/L ABA對胡椒葉片POD活性無顯著影響，當ABA處理濃度超過50 mg/L后POD顯著升高，但隨處理濃度升高對提高POD活性效果減弱。從圖3-A還可看出，與CK相比，CAT活性在T1、T2和T4處理無顯著性變化，T3處理顯著升高40.06%，即低溫脅迫下，噴施25、50和100 mg/L ABA對胡椒葉片CAT活性無顯著影響，而75 mg/L ABA處理能顯著提高胡椒葉片CAT活性。從圖3-B可看出，與CK相比，各處理的胡椒葉片SOD活性均顯著升高，分別升高28.61%、15.85%、42.64%和33.67%，其中，SOD活性在T3處理中最高，在T1與T4處理間無顯著差異，T3處理與其他處理均存在顯著差異，說明低溫脅迫下噴施低于100 mg/L的ABA能提高胡椒葉片SOD活性，以75 mg/L ABA處理效果最佳。綜上所述，低溫脅迫條件下，外源ABA處理可提高胡椒葉片中抗氧化酶活性，且不同抗氧化酶的活性提高效果不同，其中以提高POD活性效果最好，而提高CAT活性效果最差;保護酶POD、CAT和SOD活性的提高，增強了清除自由基和活性氧的能力，降低了膜脂過氧化作用，其中噴施75 mg/L ABA的效果最佳。

2. 4 外源ABA處理對低溫脅迫下胡椒葉片MDA含量的影響

逆境條件下植物膜脂常發生過氧化作用，MDA積累量是衡量植物遭受逆境傷害程度的指標（Car-valho et al.，2013;Grimaud et al.，2013）。低溫脅迫后植物體內MDA積累越多，表明植物膜結構和功能的受凍害程度越嚴重，抗寒能力越弱。由圖4可知，與CK相比，T1、T2、T3和T4處理的MDA含量均顯著下降，分別下降27.33%、29.21%、37.95%和23.86%，且隨ABA處理濃度的增加MDA含量呈先下降后上升的變化趨勢，其中T3處理的MDA含量最低，但其與T1、T2和T4處理未達顯著差異。表明低溫脅迫下噴施低于100 mg/L的ABA能顯著降低胡椒葉片細胞膜受損傷程度，不同濃度處理間無顯著差異，但以外源噴施75 mg/L ABA的效果最佳。

2. 5 外源ABA處理對低溫脅迫下胡椒葉片Fv/Fm和Fv/Fo的影響

從圖5可看出，低溫脅迫0 d時，不同濃度ABA處理的胡椒Fv/Fm和Fv/Fo無顯著差異，說明正常生長條件下，噴施不同濃度ABA對胡椒葉片的Fv/Fm和Fv/Fo沒有影響。低溫脅迫4 d時，不同濃度ABA處理的胡椒Fv/Fm和Fv/Fo均有不同程度的下降趨勢。從圖5-A可知，與低溫脅迫0 d相比，CK、T1、T2、T3和T4處理的Fv/Fm分別下降21.59%、24.63%、20.13%、13.72%和22.17%，說明低溫脅迫導致胡椒葉片Fv/Fm下降;隨著ABA處理濃度的升高，各處理的Fv/Fm呈現先上升后下降的變化趨勢，其中T3處理的Fv/Fm最高，比CK升高10.14%，且與其余處理均存在顯著差異。說明75 mg/L ABA處理能在一定程度上緩解低溫對胡椒的光抑制，提高PSII中心利用光能的效率，從而緩解光能對細胞的損傷，增強抗寒能力。從圖5-B可知，與低溫脅迫0 d相比，低溫脅迫4 d后CK、T1、T2、T3和T4處理的Fv/Fo分別下降54.58%、59.00%、53.26%、41.31%和56.72%，說明低溫脅迫導致胡椒葉片Fv/Fo下降;隨著ABA處理濃度的升高，各處理Fv/Fo呈現下降—上升—下降的變化趨勢，其中T3處理顯著高于CK和T1處理，T1、T2和T4處理與CK無顯著差異。說明50～100 mg/L ABA處理能在一定程度上緩解低溫對胡椒光系統潛在活性的抑制，其中以75 mg/L ABA處理的效果最佳。

2. 6 外源ABA處理對低溫脅迫下胡椒葉片qP、qN和Yield的影響

由圖6可知，低溫脅迫0 d時，不同濃度ABA處理胡椒的qP和Yield無顯著差異，說明正常生長條件下，噴施不同濃度ABA對胡椒葉片的qP和Yield影響不明顯;qN隨ABA處理濃度的升高，出現明顯下降趨勢，說明外源ABA處理會減弱胡椒的光保護能力。低溫脅迫4 d時，不同濃度ABA處理的胡椒葉片qP、qN和Yield均有不同程度的下降趨勢。隨著ABA處理濃度的升高，低溫脅迫下，qN呈現下降、上升再下降的趨勢，qP呈現先下降后上升的趨勢，75 mg/L ABA處理成為轉折點;與CK相比，T3處理胡椒葉片qN提高23.55%，qP下降36.47%，說明在低溫脅迫下，噴施外源ABA能提高植物的光保護能力，其中75 mg/L ABA處理的效果相對較好。低溫脅迫4 d時，Yield隨ABA處理濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，在75 mg/L ABA處理時Yield最高。在低溫脅迫下，相同ABA濃度處理的胡椒Yield均明顯下降，CK、T1、T2、T3和T4處理分別下降45.37%、37.36%、22.07%、2.78%和10.24%。說明噴施外源ABA能在一定程度上緩解低溫脅迫對胡椒的影響，其中75 mg/L ABA處理的效果較明顯。

2. 7 低溫脅迫下外源ABA處理對胡椒抗寒性相關基因表達的影響

低溫脅迫下胡椒ABA信號轉導相關基因SnRK2和PYL的表達如圖7所示。噴施水處理中，SnRK2和PYL基因在低溫脅迫后的相對表達量出現上調，且分別在脅迫48和72 h時達最高值，說明SnRK2和PYL基因受低溫脅迫誘導表達。低溫脅迫0 h時，與噴施水處理相比，噴施ABA處理的SnRK2和PYL基因相對表達量也出現明顯上調，分別上調2.93和1.37倍，說明這些基因也受ABA誘導表達。在噴施ABA處理中，SnRK2和PYL基因在低溫脅迫后多個時期出現顯著上調，且在脅迫48 h時達最高值;在同一脅迫時期噴施ABA處理2個基因的相對表達量大多數明顯高于噴施水處理，且高表達時期的出現早于噴施水處理。說明在低溫脅迫條件下，噴施ABA可誘導SnRK2和PYL基因提前并高表達，促進低溫脅迫下胡椒ABA信號的轉導。

3 討論

3. 1 葉面噴施外源ABA對低溫脅迫下胡椒生理特性的影響

前期研究發現，低溫脅迫后，胡椒葉片的POD、CAT和SOD等3種抗氧化酶活性呈顯著升高，證明低溫脅迫后胡椒為減緩寒害傷害產生了積極的防御反應。同時，不同低溫脅迫下胡椒表現不同的寒害表型，說明胡椒雖然表現積極防御低溫的能力，但能力有限（伍寶朵等，2018a）。ABA作為一種脅迫激素在植物干旱、低溫及鹽漬等逆境脅迫中起重要作用，外施ABA可代替低溫鍛煉，提高植物抗寒性（Guy，1990）。劉艷菊等（2016）研究表明，在10 ℃脅迫下噴施50～200 μmol/L ABA處理可提高油棕幼苗抗寒能力，油棕幼苗的質膜透性和SOD活性下降，滲透物質含量和POD活性提高，MDA和H2O2含量被抑制，其中以200 μmol/L ABA抗寒性效果最好。尹松松等（2016）研究表明200 μg/L ABA處理番茄幼苗提高抗寒性效果最佳。陳燕等（2019）通過測定噴施外源ABA對番木瓜幼苗葉片SOD活性、POD活性和MDA含量的影響，發現以5 mg/L ABA處理對提高抗寒性番木瓜幼苗效果最佳。因此，不同植物對施用ABA濃度敏感性各不相同，噴施外源ABA對胡椒抗寒性作用尚未清楚。

本研究結果表明，低溫脅迫后，外施不同濃度ABA可顯著降低胡椒葉片的MDA含量，其中噴施75 mg/L ABA的葉片MDA含量下降顯著，說明外施ABA可減少低溫對胡椒葉片膜結構的傷害，與方仁等（2014）對香蕉幼苗、劉艷菊等（2016）對油棕幼苗的研究結果一致。在植物受到逆境脅迫時，POD、CAT和SOD酶活性會增強，植物的抗逆能力提高。SOD可催化超氧陰離子自由基發生歧化反應生成H2O2和O2，是一類重要的清除自由基抗氧化酶;H2O2能在CAT和POD的作用下生成無毒的H2O和O2。本研究發現，低溫脅迫后外施ABA能顯著提高各處理胡椒葉片SOD活性，其中噴施75 mg/L ABA的效果最佳，說明外施ABA能促使胡椒葉片中超氧陰離子自由基向H2O2的轉化，減少脂質過氧化;25、50和100 mg/L ABA處理對胡椒葉片CAT活性無顯著影響，而外施75 mg/L ABA處理顯著提高胡椒葉片的CAT活性，同時噴施25 mg/L ABA對胡椒葉片POD活性無顯著影響，當ABA處理濃度超過50 mg/L能顯著提高POD活性。綜合分析CAT和POD的變化趨勢發現，與CK相比，外施75 mg/L ABA胡椒葉片中CAT和POD能催化更多的H2O2生成無毒的H2O和O2。

3. 2 葉面噴施外源ABA對低溫脅迫下胡椒光合特性的影響

葉綠素熒光是一種快速、靈敏無損傷評價植物光合器官損傷情況的探測手段，常用于逆境對光合作用影響的研究，是植物抗逆性鑒定的理想指標。Fv/Fm反映PSII反應中心的最大光能轉化效率，其值下降越多，表明PSII光化學效率越低，是抗寒性鑒定主要敏感指標（張守仁，1999）。C3植物在正常生長條件下Fv/Fm維持在0.8左右，但在逆境條件下會出現明顯下降趨勢（朱傅赟，2007）。本研究中，在低溫脅迫前各處理Fv/Fm介于0.77～0.78，符合前人研究的正常生長條件下Fv/Fm的變化范圍;在低溫脅迫后CK的Fv/Fm出現明顯下降（21.59%），說明低溫造成胡椒PSII光化學效率降低，影響胡椒的光合作用。李靜等（2016）研究發現，噴施外源生長調節物質可緩解低溫條件下楊樹Fv/Fm的下降趨勢;本研究中外源ABA處理可在一定程度上提高胡椒葉片Fv/Fm，與CK相比，50、75和100 mg/L ABA處理分別提高2.59%、10.14%和0.61%，說明外施ABA可緩解低溫脅迫下胡椒PSII光化學效率的下降，其中75 mg/L ABA的效果最佳。低溫脅迫條件下，Fv/Fm下降的同時若伴隨Fo的上升，表明是PSⅡ反應中心的光化學傷害引起Fv/Fm下降;若伴隨Fo的下降，表明是PSⅡ反應中心的熱耗散增加所致（李平等，2000）。本研究結果表明，在低溫脅迫下，Fv/Fm下降，并伴隨Fo的上升，各處理上升幅度為15.86%～32.48%，反映低溫脅迫已造成胡椒PSⅡ反應中心的光化學傷害，高濃度ABA處理（100 mg/L）會加劇PSⅡ反應中心的光化學傷害。王可玢等（1996）、Lootens等（2004）認為Fv/Fo是鑒定番茄和玉米品種抗寒性的可靠方法，低溫可導致植物Fv/Fo降低，抗寒性強的品種Fv/Fo下降幅度較小。本研究中，低溫脅迫后各處理Fv/Fo均明顯下降，但75 mg/L ABA處理的Fv/Fo下降幅度顯著低于CK，說明該濃度處理可緩解低溫對胡椒的傷害。

3. 3 葉面噴施75 mg/L ABA對低溫脅迫下胡椒ABA信號轉導基因表達的影響

植物耐冷性是受多個基因控制的復雜性狀（潘寶貴等，2019）。在擬南芥中PYL作為直接受體參與ABA信號轉導（Kobayashi et al.，2004）。SnRK2是一種絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，在ABA信號轉導中發揮重要作用（Asano et al.，2012）。Tian等（2013）研究發現在ABA作用和低溫脅迫條件下，TaSnRK2.3基因在普通小麥葉片中強烈表達，說明TaSnRK2.3基因受ABA和低溫誘導表達。本研究中，SnRK2和PYL基因在低溫脅迫條件下的相對表達量顯著高于低溫脅迫前，且在同一脅迫時期噴施ABA處理的相對表達量多數明顯高于噴施水處理，同時高表達時期出現也較早，說明這些基因在胡椒中可被低溫和ABA誘導高量表達，ABA處理可提前高效誘導ABA信號轉導相關基因表達，啟動和引發植物固有抗凍性基因的表達，提高植物耐凍性。在低溫脅迫條件下，ABA誘導胡椒中相關功能基因表達發生變化的原因還需進一步探究。

4 結論

外源ABA通過提高胡椒抗氧化酶活性、降低H2O2和MDA含量及緩解低溫對其光系統活性的傷害，而提高胡椒抵抗低溫脅迫的能力。外源ABA還能誘導胡椒ABA信號轉導相關基因表達，啟動和引發植株固有抗凍性基因的表達，進而提高其耐凍性。

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（責任編輯 鄧慧靈）

收稿日期：2019-12-24

基金項目：海南省自然科學基金項目（320QN346）;中國熱帶農業科學院基本科研業務費專項（1630142017010）

作者簡介：*為通訊作者，郝朝運（1979-），研究員，主要從事胡椒種質資源研究工作，E-mail：haochy79@163.com。伍寶朵（1984-），主要從事胡椒抗逆研究工作，E-mail：0204114089@163.com