高脂膳食致便溏的小鼠腸道微生物群落和代謝組學(xué)的影響

摘 要：目的：考察薏苡仁對(duì)高脂膳食致便溏的小鼠腸道微生物群落和代謝組學(xué)的影響。方法：應(yīng)用甘藍(lán)與豬油自由進(jìn)食的方式，制備脾虛小鼠模型。并以薏苡仁進(jìn)行干預(yù)，考察治療前后小鼠的體態(tài)及腸道菌群、腸道代謝組變化情況。結(jié)果：薏苡仁可以有效改善小鼠的脾虛癥狀。Phascolarctobacterium，Anaerovibrio為豐度差異性較大的菌屬，共獲得10個(gè)已報(bào)道或鑒定差異的代謝物，其緩解的便溏的主要通路為Primary bile acid biosynthesis。結(jié)論;薏苡仁可通過對(duì)腸道微生物及代謝物調(diào)節(jié)的方式改善便溏的癥候。

關(guān)鍵詞：薏苡仁;脾虛便溏;微生物組學(xué);代謝組學(xué)

根據(jù)腸道代謝特點(diǎn)可知，發(fā)生脾虛便溏會(huì)導(dǎo)致排出糞便粘性增加，與正常糞便相比，溏便類似溏泥，其黏性大，濕度高。同水樣便相比，流動(dòng)性差;同便秘便相比，其質(zhì)地滑膩，是結(jié)腸消化系統(tǒng)異常的一種表現(xiàn)。考慮到糞便的形態(tài)主要受到胃/小腸的消化情況及大腸部位菌群生長(zhǎng)發(fā)酵的影響，糞便的形態(tài)可以直接反映人體的消化系統(tǒng)及腸道菌群的異常。

從營(yíng)養(yǎng)代謝的角度出發(fā)，便溏同飲食關(guān)系密切。不考慮消化系統(tǒng)疾病/細(xì)菌感染的影響，油脂（如飽和脂肪酸、動(dòng)物脂肪等）攝入過多，消化系統(tǒng)無法充分吸收，是產(chǎn)生便溏的主因之一。另一方面，與正常糞便相比，溏便水分及油脂含量高，在結(jié)腸段囤積的過程中，亦有可能反向影響腸道菌群的構(gòu)成。

1 材料與方法

1.1 小鼠模型制備

模型小鼠共計(jì)28只，隨機(jī)分為4組：模型組（高脂膳食建模）、空白組（不進(jìn)行高脂膳食建模常規(guī)飼養(yǎng)）、及對(duì)照組（高脂膳食建模后飼食常規(guī)鼠糧），自由進(jìn)食。單日喂食甘藍(lán)10-15g/只，雙日灌胃豬油3ml/只，自由進(jìn)食、飲水。觀察小鼠飲食周期，一般連續(xù)7d后，小鼠出現(xiàn)便溏。待小鼠糞便持續(xù)呈高濕高黏的塘泥狀3d，確認(rèn)模型建立成功。實(shí)驗(yàn)持續(xù)28d，取待測(cè)小鼠，禁食12h，喂食1g對(duì)應(yīng)食物，3h后處死小鼠，取全部結(jié)腸，收集腸道內(nèi)容物，作進(jìn)一步研究。

1.2 腸道菌群特征

應(yīng)用E.Z.N.A.Stool DNA Kit試劑對(duì)樣本總DNA進(jìn)行提取，對(duì)rRNA基因可變區(qū)（V3+V4）或特定基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將合格的各上機(jī)測(cè)序文庫（Index序列不可重復(fù)）梯度稀釋后，并經(jīng)過NaOH aq變性為單鏈，再使用MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行2×300bp的雙端測(cè)序。

1.3 腸道代謝組特征

利用高效液相色譜串聯(lián)高分辨率質(zhì)譜儀TripleTOF 5600在正、負(fù)離子模式下，分別對(duì)小鼠的腸道代謝組檢測(cè)。數(shù)據(jù)處理應(yīng)用Simca-P+14.1軟件進(jìn)行多變量數(shù)據(jù)分析。在MBROLE，MetaboAnalyst數(shù)據(jù)庫內(nèi)，對(duì)Model-Coix組內(nèi)的差異代謝物進(jìn)行KEGG功能富集分析，以確定薏苡仁對(duì)于模型小鼠代謝調(diào)控的機(jī)制。

2 結(jié)果

顯示經(jīng)過不同飼養(yǎng)后，小鼠糞便內(nèi)的微生物群落變化情況。由結(jié)果可知，門水平下各組的微生物群落結(jié)構(gòu)并無顯著性差異（P>0.05）。上述三組的優(yōu)勢(shì)菌種分別為Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria。該結(jié)果提示，本研究各組間在門水平下的差異性不大。本研究進(jìn)一步分析了各組在屬水平下的差異中列出了豐度最高的20個(gè)菌屬的構(gòu)成。經(jīng)過對(duì)差異性的分析后可篩選出三組在屬水平下，有差異性（p<0.05）的菌屬包含：Streptophyta，Enterobacter，Mobilitalea，Clostridium，Phascolarctobacterium，Candidatus_Stoquefichus，F(xiàn)aecalimonas，F(xiàn)aecalibaculum，Anaerovibrio，Deltaproteobacteria_unclassified，Acutalibacter11個(gè)，其中，以Phascolarctobacterium，Anaerovibrio為豐度較大的菌屬。該結(jié)果提示，上述兩個(gè)菌屬為薏苡仁緩解便溏過程中，影響較大的菌屬。

經(jīng)過對(duì)各組內(nèi)差異代謝物的定量分析后可知，Control-Model組內(nèi)，共有649個(gè)上調(diào)和346個(gè)下調(diào)的差異陽離子代謝物，781個(gè)上調(diào)和320個(gè)下調(diào)的差異陰離子代謝物。Model-Coix組內(nèi)，共有139個(gè)上調(diào)和60個(gè)下調(diào)的差異陽離子代謝物，213個(gè)上調(diào)的和99個(gè)下調(diào)的差異陰離子代謝物。最終共獲得了5個(gè)上調(diào)和1個(gè)下調(diào)的差異陽離子代謝物，26個(gè)上調(diào)的和0個(gè)下調(diào)的差異陰離子代謝物。對(duì)上述32個(gè)化合物進(jìn)行KEGG功能富集后，共獲得10個(gè)已報(bào)道/鑒定的化合物，Spergualin Promazine，N1，N12-Diacetylspermine，Isolithocholate，Gymnodimine，Diisononyl_phthalate，Cassaidine，6-Ethylchenodeoxycholic_acid，3-Oxo-5beta-cholanate，3alpha，7alpha，12alpha，26-Tetrahydroxy-5beta-cholestane和Paspaline。薏苡仁對(duì)于模型小鼠的代謝通路共有38條，然而，除了Primary bile acid biosynthesis通路的p值<0.05外，其他代謝通路的p值>0.05。該結(jié)果提示，薏苡仁緩解的便溏的主要通路為Primary bile acid biosynthesis。

3 討論

通過深入考察便溏小鼠腸道內(nèi)的腸道菌群-宿主代謝組學(xué)特點(diǎn)，本研究篩選此過程中的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物;再對(duì)比解析便溏小鼠腸道酸環(huán)境及菌群構(gòu)成的影響，從而遞進(jìn)式的揭示其調(diào)控機(jī)制。本研究從代謝角度解釋脾虛便溏癥候?qū)δc道代謝乃至微生物群落的影響，亦可為后續(xù)的脾虛癥候、藥物以及復(fù)方研究提供研究基礎(chǔ)，并為未來進(jìn)一步的癥候發(fā)生的機(jī)制研究提供相應(yīng)的指導(dǎo)。

課題項(xiàng)目：本項(xiàng)目受遼寧經(jīng)濟(jì)職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研處項(xiàng)目支持（編號(hào)Ljz2018-qn-07）

作者簡(jiǎn)介：蔣亦昕（1988-），女，廣西桂林人，漢族，碩士，講師，研究方向：生物信息學(xué)。