高脂膳食致便溏的小鼠腸道微生物群落和代謝組學的影響

摘 要：目的：考察薏苡仁對高脂膳食致便溏的小鼠腸道微生物群落和代謝組學的影響。方法：應用甘藍與豬油自由進食的方式，制備脾虛小鼠模型。并以薏苡仁進行干預，考察治療前后小鼠的體態及腸道菌群、腸道代謝組變化情況。結果：薏苡仁可以有效改善小鼠的脾虛癥狀。Phascolarctobacterium，Anaerovibrio為豐度差異性較大的菌屬，共獲得10個已報道或鑒定差異的代謝物，其緩解的便溏的主要通路為Primary bile acid biosynthesis。結論;薏苡仁可通過對腸道微生物及代謝物調節的方式改善便溏的癥候。

關鍵詞：薏苡仁;脾虛便溏;微生物組學;代謝組學

根據腸道代謝特點可知，發生脾虛便溏會導致排出糞便粘性增加，與正常糞便相比，溏便類似溏泥，其黏性大，濕度高。同水樣便相比，流動性差;同便秘便相比，其質地滑膩，是結腸消化系統異常的一種表現。考慮到糞便的形態主要受到胃/小腸的消化情況及大腸部位菌群生長發酵的影響，糞便的形態可以直接反映人體的消化系統及腸道菌群的異常。

從營養代謝的角度出發，便溏同飲食關系密切。不考慮消化系統疾病/細菌感染的影響，油脂（如飽和脂肪酸、動物脂肪等）攝入過多，消化系統無法充分吸收，是產生便溏的主因之一。另一方面，與正常糞便相比，溏便水分及油脂含量高，在結腸段囤積的過程中，亦有可能反向影響腸道菌群的構成。

1 材料與方法

1.1 小鼠模型制備

模型小鼠共計28只，隨機分為4組：模型組（高脂膳食建模）、空白組（不進行高脂膳食建模常規飼養）、及對照組（高脂膳食建模后飼食常規鼠糧），自由進食。單日喂食甘藍10-15g/只，雙日灌胃豬油3ml/只，自由進食、飲水。觀察小鼠飲食周期，一般連續7d后，小鼠出現便溏。待小鼠糞便持續呈高濕高黏的塘泥狀3d，確認模型建立成功。實驗持續28d，取待測小鼠，禁食12h，喂食1g對應食物，3h后處死小鼠，取全部結腸，收集腸道內容物，作進一步研究。

1.2 腸道菌群特征

應用E.Z.N.A.Stool DNA Kit試劑對樣本總DNA進行提取，對rRNA基因可變區（V3+V4）或特定基因片段進行PCR擴增。將合格的各上機測序文庫（Index序列不可重復）梯度稀釋后，并經過NaOH aq變性為單鏈，再使用MiSeq測序儀進行2×300bp的雙端測序。

1.3 腸道代謝組特征

利用高效液相色譜串聯高分辨率質譜儀TripleTOF 5600在正、負離子模式下，分別對小鼠的腸道代謝組檢測。數據處理應用Simca-P+14.1軟件進行多變量數據分析。在MBROLE，MetaboAnalyst數據庫內，對Model-Coix組內的差異代謝物進行KEGG功能富集分析，以確定薏苡仁對于模型小鼠代謝調控的機制。

2 結果

顯示經過不同飼養后，小鼠糞便內的微生物群落變化情況。由結果可知，門水平下各組的微生物群落結構并無顯著性差異（P>0.05）。上述三組的優勢菌種分別為Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria。該結果提示，本研究各組間在門水平下的差異性不大。本研究進一步分析了各組在屬水平下的差異中列出了豐度最高的20個菌屬的構成。經過對差異性的分析后可篩選出三組在屬水平下，有差異性（p<0.05）的菌屬包含：Streptophyta，Enterobacter，Mobilitalea，Clostridium，Phascolarctobacterium，Candidatus_Stoquefichus，Faecalimonas，Faecalibaculum，Anaerovibrio，Deltaproteobacteria_unclassified，Acutalibacter11個，其中，以Phascolarctobacterium，Anaerovibrio為豐度較大的菌屬。該結果提示，上述兩個菌屬為薏苡仁緩解便溏過程中，影響較大的菌屬。

經過對各組內差異代謝物的定量分析后可知，Control-Model組內，共有649個上調和346個下調的差異陽離子代謝物，781個上調和320個下調的差異陰離子代謝物。Model-Coix組內，共有139個上調和60個下調的差異陽離子代謝物，213個上調的和99個下調的差異陰離子代謝物。最終共獲得了5個上調和1個下調的差異陽離子代謝物，26個上調的和0個下調的差異陰離子代謝物。對上述32個化合物進行KEGG功能富集后，共獲得10個已報道/鑒定的化合物，Spergualin Promazine，N1，N12-Diacetylspermine，Isolithocholate，Gymnodimine，Diisononyl_phthalate，Cassaidine，6-Ethylchenodeoxycholic_acid，3-Oxo-5beta-cholanate，3alpha，7alpha，12alpha，26-Tetrahydroxy-5beta-cholestane和Paspaline。薏苡仁對于模型小鼠的代謝通路共有38條，然而，除了Primary bile acid biosynthesis通路的p值<0.05外，其他代謝通路的p值>0.05。該結果提示，薏苡仁緩解的便溏的主要通路為Primary bile acid biosynthesis。

3 討論

通過深入考察便溏小鼠腸道內的腸道菌群-宿主代謝組學特點，本研究篩選此過程中的關鍵代謝產物;再對比解析便溏小鼠腸道酸環境及菌群構成的影響，從而遞進式的揭示其調控機制。本研究從代謝角度解釋脾虛便溏癥候對腸道代謝乃至微生物群落的影響，亦可為后續的脾虛癥候、藥物以及復方研究提供研究基礎，并為未來進一步的癥候發生的機制研究提供相應的指導。

課題項目：本項目受遼寧經濟職業技術學院科研處項目支持（編號Ljz2018-qn-07）

作者簡介：蔣亦昕（1988-），女，廣西桂林人，漢族，碩士，講師，研究方向：生物信息學。