蒙藥蘇格木勒一3湯不同部位中4種成分的含量測定

王樹梅 韓金美 烏日罕 薩礎拉

中圖分類號R927，2

文獻標志碼A

文章編號1001-0408（2020）02-0144-05

DOI

10.603 9/j .issn.1001-0408.2020.02.04

摘要 目的：建立測定蒙藥蘇格木勒一3湯水提物中芹菜素、胡椒堿及其揮發油中按油精、枯茗醛含量的方法。方法：采用高效液相色譜法（HPIC）測定芹菜素、胡椒堿的含量;采用氣相色譜法（GC）測定桉油精、枯茗醛的含量。HPLC法采用色譜柱為AgilentEclipse XDB-C18，流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，流速為1.0 mL/min，檢測波長為225（芹菜素）、342 nm（胡椒堿），柱溫為30℃，選樣量為10 μL。GC法采用色譜柱為Dimensions SH-Rtx-I毛細管柱，載氣為高純氫氣，進樣口溫度為270℃，載氣流量為1mL/min，程序升溫，進樣量為10 μL，進樣分流比為1：10。結果：芹菜素、胡椒堿、桉油精、枯茗醛檢測質量濃度的線性范圍分別為12.5-200 μg/mL（r=0.999 6）、87.3-139.7μg/mL（r= 0.999 9）.136-2 187 μg/mL（r=0.999 9）、39-635 μg/mL（r=0.999 9）;定量限分別為0.02、0.06、0.06、0.12 μg/mL;檢測限分別為0.01、0.02、0.03、0.04 μg/mL;精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于4%;加樣回收率分別為89.26% -97.26%（RSD= 2.69%，n=6）、94.20% - 104.01%（RSD= 3.64%，n=6）、98.51% - 110.11 qo（ RSD= 3.87%，n=6）、95.76% -107.82%（RSD=4.12%，n=6）;含量分別為0.769-0.828、7.741-7.981、5.284 7-5.846 6、1.038 6-1.101 2 mg/g（n=3）。結論：所建方法簡單、可行，可用于蒙藥蘇格木勒-3湯不同部位的質量控制。

關鍵詞 高效液相色譜法;氣相色譜法;蘇格木勒-3湯;水提物;揮發油;芹菜素;胡椒堿;按油精;枯茗醛;含量測定

蒙藥蘇格木勒一3湯始載于《四部醫典》[1]，其味辛，性溫，具有抑“赫依”（蒙醫指具有調節人體機制平衡的物質）作用[2]，在治療失眠方面具有顯著療效[3-5]。蘇格木勒一3湯主要由白豆蔻、香旱芹、蓽茇等3味藥材組成。方中白豆蔻（蒙文名為蘇格木勒）為主藥，可祛腎寒、抑赫依、溫中消食，主治腎赫依病、失眠、消化不良等[6]，主要含有揮發油類成分，以桉油精含量最高[7]，具有降血糖、保護腎臟嘲、鎮靜、催眠[9-11]等作用;香旱芹為輔藥，具有清肺熱、提升胃火、消食的功效[6]，主要含有黃酮及揮發油類成分，具有抗氧化[12]、降糖[13]、鎮靜、催眠[9-11]等作用;蓽茇為佐藥，具有抑赫依、調理體素、化痰、止痛等功效[6]，主要含有生物堿及酰胺類、揮發油類、木脂素類、萜類、甾醇類等成分[14]，具有保護胃黏膜[16]、鎮靜、催眠[9-11]等作用。

目前關于蘇格木勒一3湯的研究主要為臨床觀察，對于其質量控制及有效物質基礎等方面的研究較少。本課題組前期對蘇格木勒一3湯的揮發油部位與水提物部位分別進行了藥效學研究，結果發現兩者均具有治療失眠的作用。雖然有研究對蘇格木勒一3水提物或揮發油的藥效組分進行了測定[16-18]，但這些研究多以單一成分作為評價指標，難以全面評估其質量。基于此，本研究采用高效液相色譜法（HPIC）同時測定蘇格木勒一3湯水提物芹菜素、胡椒堿（分別來自組方藥材香旱芹、蓽茇）的含量;采用氣相色譜法（GC）同時測定其揮發油中桉油精、枯茗醛的含量，旨在為該方劑質量標準的提高和后續二次開發及體內藥效物質基礎研究提供依據。

1 材料

1.1 儀器

U3000型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器、四元梯度泵（美國Thermo Fisher公司）;AL204型電子分析天平（美國Mettler-Toledo公司）;KQ-250型超聲波清洗機（鞏義予華儀器有限責任公司）;GC-2014AFSC型GC儀，包括自動進樣器、氫火焰離子化檢測器[島津企業管理（中國）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

芹菜素對照品（批號：111901-201603，純度：99.2%）、胡椒堿對照品（批號：110775-201405，純度：98.9%）、桉油精對照品（批號：110788-201707，純度：100%）均由中國食品藥品檢定研究院提供;枯茗醛對照品[安倍爾實驗室技術（上海）有限公司，批號：R4030004，純度：95%];正己烷為分析純，甲醇及其余試劑均為色譜純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

白豆蔻（批號：冀20100139）、香旱芹（批號：冀20100139）、蓽茇（批號：冀20100139）均購于內蒙古田里藥材公司，經內蒙古醫科大學蒙醫藥學院圖門巴雅爾教授鑒定分別為姜科植物白豆蔻（Amomum， kravanhPierre ex Gagnep）和爪哇白豆蔻（A.compactum Soland.ex Maton）的果實、傘形科植物孜然芹（Cuminum cvrmi-num L.）的成熟果實、胡椒科植物蓽茇（Piper longum L）的干燥未成熟或成熟果穗。

2 方法與結果

2.1 HPLC法測定蘇格木勒.3湯水提物中芹菜素和胡椒堿的含量

2.1.1 蘇格木勒一3湯水提物的制備 取蘇格木勒一3湯[白豆蔻一香旱芹一蓽茇（3：2：1，m/m/m）]50 g，加1 000mL水，煎煮30 min后，濾過，濾液蒸干，得到蘇格木勒一3湯水提物（9 g，得率為18%）。共制備9批樣品。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mmx4.6 mm，5μm）;流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液;流速：1.O mL/min;進樣量：10 μL;柱溫：30℃;檢測波長：225 nm（芹菜素）、342 nm（胡椒堿）。

2.1.3 混合對照品溶液的制備取芹菜素、胡椒堿對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成含芹菜素、胡椒堿質量濃度分別為0.200、1.397 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備精密稱取“2.1.1”項下蘇格木勒一3湯水提物約1g，加25%鹽酸溶液2 mL、甲醇10mL，稱定質量，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.5 空白對照溶液以甲醇為空白對照溶液。

2.1.6 系統適用性試驗取上述混合對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液各10 μL，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在混合對照品溶液和供試品溶液色譜圖上有相同保留時間的色譜峰，理論板數按芹菜素、胡椒堿計均不低于3 000，各成分分離度均大于1.5，空白對照對測定無干擾。

2.1.7 線性關系考察取“2.1.3”項下混合對照品溶液適量，用甲醇依次稀釋1、2、4、8、16倍后分別精密吸取10 μL，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得芹菜素回歸方程為y=673.24x+1.212 1（r=0.999 6），胡椒堿回歸方程為y=1 145.2x+9.370 5（r=0.999 9）。結果表明，芹菜素、胡椒堿分別在12.5～200、87.3～139.7 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.8 定量限與檢測限考察取“2.1.3”項下混合對照品溶液適量，用甲醇倍比稀釋，按“2.1.2”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。分別以信噪比10：1、3：1計算定量限、檢測限。結果，芹菜素、胡椒堿的定量限分別為0.02、0.06 μg/mL，檢測限分別為0.01、0.02 μg/mL。

2.1.9 精密度試驗取“2.1.3”項下混合對照品溶液適量，按“2.1.2”項下色譜條件連續進樣測定5次，記錄峰面積。結果，芹菜素、胡椒堿峰面積的RSD分別為1.29%、0.85%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.1.10 穩定性試驗取“2.1.4”項下供試品溶液適量，分別在制備后于室溫下放置2、4、8、10、12 h時，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，芹菜素、胡椒堿峰面積的RSD分別為3.27%、1.84%（n=5），表明供試品溶液制備后12h內基本穩定。

2.1.11 重復性試驗取“2.1.1”項下蘇格木勒一3湯水提物約1 g，共6份，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。結果，芹菜素、胡椒堿含量的RSD分別為1.93%、1.2%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.1.12 加樣回收率試驗取已知含量的“2.1.1”項下蘇格木勒一3湯水提物，共6份，每份約1 g，精密稱定，加入“2.1.3”項下混合對照品溶液適量，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

2.1.13 樣品含量測定精密稱取9批“2.1.1”項下蘇格木勒一3湯水提物適量，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，平行操作3次，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量，結果見表2。

2.2 GC法測定蘇格木勒.3湯揮發油中桉油精和枯茗醛的含量

2.2.1 蘇格木勒一3湯揮發油的制備 取蘇格木勒-3湯[白豆蔻一香旱芹一蓽茇（3：2：1，m /m/m ）]50 g，置于圓底燒瓶中，加500 mL水振搖混勻，適當浸泡，緩慢加熱至沸后保持微沸1h，再放冷至室溫，收集揮發油，過無水硫酸鈉，得蘇格木勒一3湯揮發油（1.9 g，得率為3.8%）。共制備9批樣品。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：Dimensions SH-Rtx-1毛細管柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）;載氣：高純氫氣;進樣口溫度：270℃;載氣流量：1 mL/min;程序升溫（初始溫度為80℃，保持1 min，以30 ℃/min升溫至200℃保持5min）;進樣量：10 μL;進樣分流比：1： 10。

2.2.3 混合對照品溶液的制備取桉油精、枯茗醛對照品各適量，精密稱定，加正己烷制成含桉油精、枯茗醛質量濃度分別為2.187、0.635 mg/mL的混合對照品溶液，即得。

2.2.4 供試品溶液的制備精密稱取“2.2.1”項下蘇格木勒一3湯揮發油約10 mg，加正己烷定容至10 mL，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.5 空白對照溶液以正己烷為空白對照溶液。

2.2.6 系統適用性試驗取上述混合對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液各適量，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖2。由圖2可知，在混合對照品溶液和供試品溶液色譜有相同保留時間的色譜峰，理論板數按桉油精、胡椒堿計均不低于3 000，各成分分離度均大于1.5，空白對照對測定無干擾。

2.2.7 線性關系考察取“2.2.3”項下混合對照品溶液，用正己烷依次稀釋1、2、4、8、16倍后分別精密吸取10μL，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得桉油精回歸方程為y=869 874x- 10 366（r=0.999 9），枯茗醛回歸方程為y=821 87lx-4 001.8（r=0.999 9）。結果表明，桉油精、枯茗醛分別在136～2 187、39～635 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.8定量限與檢測限考察精密量取“2.2.3”項下混合對照品溶液適量，用正己烷倍比稀釋，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。分別以信噪比10：1、3：1計算定量限、檢測限。結果，桉油精、枯茗醛的定量限分別為0.06、0.12 μg/mL，檢測限分別為0.03、0.04μg/mL。

2.2.9 精密度試驗取“2.2.3”項下混合對照品溶液1mL，置于10 mL量瓶中，加正己烷稀釋并定容，搖勻，按“2.2.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，桉油精、枯茗醛峰面積的RSD分別為0.69%、0.94%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.10 穩定性試驗取“2.2.4”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置2、4、8、10、12 h時，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，桉油精、枯茗醛峰面積的RSD分別為1.53%、1.21%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內基本穩定。

2.2.11 重復性試驗取“2.2.1”項下蘇格木勒一3湯揮發油約50 mg，共6份，精密稱定，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。結果，桉油精、枯茗醛含量的RSD分別為0.40%、0.71%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.2.12 加樣回收率試驗稱取已知含量的“2.2.1”項下蘇格木勒一3湯揮發油，共6份，每份約10 mg，精密稱定，加入“2.2.3”項下混合對照品溶液適量，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

2.2.13 樣品含量測定精密稱取9批“2.2.1”項下蘇格木勒一3湯揮發油適量，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，平行操作3次，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量，結果見表4。

3 討論

在前期預試驗中，筆者對芹菜素、胡椒堿在200～400 nm波長范圍內進行二極管陣列檢測，結果顯示，芹菜素、胡椒堿分別在225、342 nm波長處有最大吸收峰，故選擇225、342 nm分別進行檢測。本課題組前期分別以甲醇、乙醇、甲醇-25%鹽酸溶液為溶劑制備蘇格木勒一3湯水提物供試品溶液，結果顯示，以甲醇-25%鹽酸溶液為溶劑時能很好地保護醛基，故選擇其作為溶劑;同時又考察了超聲提取和回流提取對提取效果的影響，結果發現，超聲提取時提取率高、時間短、溫度低，有效成分易于分離、純化;此外，還比較了甲醇一水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈一水等不同流動相系統的分離效果，結果顯示，以甲醇-0.1%磷酸水為流動相時，各待測成分與其他成分可達到基線分離，且出峰快、保留時間短、色譜峰峰形理想、分離度好，故選擇其作為流動相。

蒙藥復方制劑的功效是藥品內含成分整體作用的體現，是多種成分、多種機制綜合作用的結果，因此單個活性成分含量不能反映其整體療效[19]。隨著分析技術的發展，同時測定復方制劑中多個有效成分已成為控制其質量的發展趨勢[20]。例如，裴貴珍等[21]采用HPLC法測定維藥艾米斯丸中芹菜素、胡椒堿、木香烴內酯、去氫木香烴內酯的含量;涂明珠等[22]采用GC法測定復方薄樟桉油溶液中桉油精、樟腦、薄荷腦的含量。在本研究中，筆者參考上述文獻，以芹菜素、胡椒堿、桉油精和枯茗醛為指標進行含量測定，所建方法操作簡單、重復性好，可為蘇格木勒一3湯的質量控制提供技術支持。

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（收稿日期：2019-07-30修回日期：2019-11-06）

（編輯：陳宏）

△基金項目：國家自然科學基金資助項目（No.81560705）;內蒙古醫科大學蒙醫學“一流學科”科學研究重點項目（ No.myx-ylxk2019-01）;內蒙古醫科大學蒙醫學“一流學科”科學研究研究生創新項目（No.myxylxk201928）;內蒙古醫科大學蒙藥學“一流學科”蒙藥專業研究生科研能力提升項目（No.myxylxkky2019-04）

* 碩士研究生。研究方向：蒙（中）藥藥效物質基礎及質量控制。E-mail： 897894126@qq.com

# 通信作者：副教授，碩士生導師，博士。研究方向：蒙（中）藥藥效物質基礎及質量控制。電話：0471-6657613。E-mail： haisachula@126.com