川芎嗪涂膜劑的制備及其體外經皮滲透特性研究

王穎 何亞楠 車逸豪 袁仕夢 趙海榮 巫秀美 楊志斌

中圖分類號R969;R541

文獻標志碼A

文章編號1001-0408（2020）02-0160-05

DOI

10.6039/{.issn.1 001-0408.2020.02.07

摘 要 目的：初步優選川芎嗪涂膜劑的制備工藝，并研究其體外經皮滲透特性。方法：采用單因素試驗，以聚乙烯醇（PVA-124）、無水乙醇、甘油、吐溫80、氮酮的用量為因素，采用改良的評分標準對涂膜劑基質的成膜時間、成膜性、延展性、均勻度和有無氣泡等指標進行評價，優選川芎嗪涂膜劑基質處方。在優選基質處方的基礎上制備備不同載藥量川芎嗪（300、250、200、150、100、50 mg/mL）的涂膜劑，并考察其最大載藥量。采用高效液相色譜法測定川芎嗪含量，并進行方法學考察。取離體大鼠背部皮膚，對高、中、低載藥量（100、75、50 mg/mL）川芎嗪涂膜劑進行體外經皮滲透試驗，分別于第15、30、45、60、75、90、120、150、180 min時取樣測定，并計算川芎嗪的滲透速率。結果：PVA-124、無水乙醇、甘油、吐溫80、氮酮的用量分別為2.5 9、7.0 mL、1.97mL、0.07 mL、0.28 mL（以50 mL處方量計）時的川芎嗪涂膜劑基質處方為最優;川芎嗪的最大載藥量為100 mg/mL。川芎嗪含量測定方法的線性范圍為3.125-100 μg/mL，其專屬性、精密度、重復性、回收率、穩定性考察均符合要求（RSD均小于2%）;高、中、低載藥量川芎嗪涂膜劑的滲透速率分別為608.42、384.19、158.20 μg/（cm2.h）。結論：按優選處方制備的川芎嗪涂膜劑成膜時間短、質量穩定可靠，載藥量可達100 mg/mL;75 mg/mL載藥量的涂膜劑即可達到川芎嗪有效治療血藥濃度的滲透速率范圍。

關鍵詞 川芎嗪;涂膜劑;處方優化;大鼠;經皮滲透試驗;滲透速率

近年來，我國心腦血管疾病發病率高且呈上升趨勢，截至2017年我國心腦血管病患者人數已達到2.9億，多數患者需長期服藥[1-2]。中醫藥在臨床用于心腦血管疾病的治療已有較多實踐及報道，開發中藥成分類心腦血管疾病治療的新型制劑具有重要意義。川芎嗪，又名四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine，TMPZ），是從中藥川芎中提取的一種活性生物堿，具有活血化淤的功能[3]，是治療心腦血管疾病的有效成分[4]。已上市的川芎嗪制劑主要包括口服制劑和注射劑等，但易引起胃部不適及累積性中毒等不良反應[5]。為改善上述問題，國內外研究者研制開發了川芎嗪的體外透皮吸收劑型，如貼劑、凝膠劑和軟膏劑等外用制劑，并取得了一定進展[6-8]，但尚未見到有關川芎嗪涂膜劑的制備及對其透皮吸收規律的研究。涂膜劑是將藥物溶解或分散于含成膜材料的溶劑中，涂抹后可逐漸釋放藥物從而起治療作用的一種新型外用劑型，具有無首關效應、生物半衰期長、藥物毒副作用小等優點，并可提高患者服藥依從性[9-12]。基于此，本研究擬制備一種川芎嗪涂膜劑并優選其制備方法，同時研究其透皮吸收特性，旨在為該劑型的后續開發奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

TPY-2型藥物透皮擴散試驗儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）;BSA124S型微量電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司];TCL-16M型臺式高速冷凍離心機（湖南湘立科學儀器有限公司）;DHG-9240型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）;VORTEX-5型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;1260Infrnity型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;SK8200H型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）;HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）;DZG-303A型超純水機（上海艾柯儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

川芎嗪原料藥（深圳市麗晶生化科技有限公司，批號：11032-118，純度：≥99%）;川芎嗪對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110817-201608，純度：≥98%）;0.9%氯化鈉注射液（昆明南疆制藥有限公司，批號：C150120L;作為生理鹽水使用）;薇婷脫毛膏[利潔時家化（中國）有限公司，批號：J20140017];乙腈（色譜純，北京百靈威科技有限責任公司，批號：17115012，色譜純）;聚乙烯醇124（PVA-124，西隴化工股份有限公司，批號：151024）;無水乙醇（天津市福晨化學試劑廠，批號：20161008）;甘油（浙江遂昌惠康藥業有限公司，批號：20141230）;吐溫80（上海索萊寶生物科技有限公司，批號：626N047）;氮酮（湖北科捷制藥有限公司，批號：161201）;乙腈（北京百靈威科技有限責任公司，批號：17115012，色譜純）;其他試劑均為國產分析純，水為超純水。

1.3 動物

健康成年SD大鼠，清潔級，雄性，體質量180～220g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002。大鼠在大理大學實驗動物中心適應性飼養1～2周后，用于后續實驗。飼養條件：清潔級，室溫16～22℃，相對濕度70%，12 h明暗交替照明，動物自由進食、飲水。動物處置方法均符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則要求。

2 方法與結果

2.1 川芎嗪涂膜劑制備方法的優化

2.1.1 涂膜劑基質的制備參照文獻方法[13]，按處方量稱取成膜材料PVA-124適量，加水密封浸潤24 h，于90℃水浴下溶脹至凝膠狀，取出放涼;邊攪拌邊向PVA-124凝膠溶液中依次加入處方量的無水乙醇、甘油、吐溫80、氮酮，攪拌使之分散均勻，最后加水至足量，得黏稠狀涂膜劑基質。

2.1.2 涂膜劑基質的評價方法取“2.1.1”項下涂膜劑基質1 mL均勻涂抹于3 cmx3 cm的玻璃板上，以成膜時間、成膜性、延展性、均勻度以及有無氣泡等作為指標進行評價[14]，評分標準見表1。由于成膜時間（a）和成膜性（b）是評價涂膜劑的重要指標，故設定其權重為0.3;延展性（c）、均勻度（d）、有無氣泡（e）均由直接觀察得到，存在一定主觀性，故設定其權重為0.2。按公式計算綜合評分（y）：y=0.3×（a+b）+0.2×（c+d+e）。

2.1.3 單因素試驗優化基質處方根據前期預試驗考察結果，對基質影響最大的5個因素分別為PVA-124用量（A）、無水乙醇用量（B）、甘油用量（C）、吐溫80用量（D）和氮酮用量（E）。對上述因素分別進行考察及處方優化：（I）PVA-124用量：在基質處方的其他成分基本不變的情況下，設置PVA-124用量分別為1.5、2.0、2.5、3.0g（基質處方量均以50 mL計，以下同）;（2）無水乙醇用量：在基質處方的其他成分基本不變的情況下，設置無水乙醇體積分數分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 mL;（3）甘油用量：在基質處方的其他成分基本不變的情況下，設置甘油用量分別為1.77、1.97、2.17、2.37 mL;（4）吐溫80用量：在基質處方的其他成分基本不變的情況下，設置吐溫80用量分別為0.05、0.07、0.09、0.11 mL;（5）氮酮用量：在基質處方的其他成分基本不變的情況下，設置氮酮用量分別為0.26、0.28、0.30、0.32 mL。

根據上述不同因素水平和“2.1.1”項下方法分別制備涂膜劑基質（處方中不足部分以水補足）。對所制備的涂膜劑基質樣品采用“2.1.2”項下評分標準進行評價。結果顯示，PVA-124、無水乙醇、甘油、吐溫80、氮酮的用量分別為2.5 g、7.O mL、1.97 mL、0.07 mL、0.28 mL時，相應的基質綜合評分最高，詳見表2。

2.1.4 涂膜劑載藥量的考察在“2.1.3”項下優選的基質處方基礎上制備含不同載藥量川芎嗪（300、250、200、150、100、50 mg/mL）的涂膜劑，再按“2.1.2”項下的評分標準優選川芎嗪涂膜劑的載藥量。結果顯示，當載藥量≤100 mg/mL時，所制備的川芎嗪涂膜劑體系分散均勻，成膜完整連續，易于涂布，成膜時間在5 min以內，且不會出現藥物析出等現象，故將100 mg/mL設定為該涂膜劑的最大載藥量。

2.1.5 川芎嗪涂膜劑的制備按基質處方工藝和載藥量考察結果，稱取PVA-124 5.Og，加入水80 mL密封浸潤24 h后，于90℃水浴下溶脹至凝膠狀，取出放涼;邊攪拌邊向PVA-124凝膠溶液中加入川芎嗪10 g，再依次緩慢加入無水乙醇溶液14 mL、甘油4 mL、吐溫80 0.15mL、氮酮0.55 mL，攪拌使之分散均勻，最后加水至100mL，即得黏稠狀的川芎嗪涂膜劑（載藥量100 mg/mL）。同法制備載藥量為75、50 mg/mL的川芎嗪涂膜劑，用于后續試驗。

2.2 川芎嗪含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件色譜柱：Symmetry-C18（250 mmx4.6mm，5μm）;流動相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～20min， 5%B→41%B）;流速：1.0 mL/min;柱溫：35℃;檢測波長：280 nm;進樣量：5μL。

2.2.2 線性關系考察精密稱取川芎嗪對照品10 mg，加生理鹽水溶解并定容至50 mL，制得200 μg/mL的對照品母液。取上述對照品母液適量，以生理鹽水稀釋制成質量濃度分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的系列對照品溶液。取上述系列對照品溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件分別進樣檢測，平行操作3次。以峰面積為縱坐標（y）、質量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸，得標準曲線y=7.398 9x-2.286 2（r=0.999 9）。結果表明，川芎嗪質量濃度在3.125～100 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.3 專屬性試驗取未給藥大鼠的背部皮膚，加生理鹽水適量研磨后制成空白皮膚勻漿液后備用;取空白涂膜劑基質，加生理鹽水適量稀釋后備用;取體外經皮滲透試驗3h時的接收液凍干樣品，加適量生理鹽水溶解后備用;取川芎嗪原料藥，加適量空白皮膚勻漿液溶解后備用;取川芎嗪原料藥，加適量生理鹽水溶解后備用。取上述溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件分別進樣檢測，記錄色譜圖。結果顯示，各色譜峰分離良好，無雜質峰干擾，表明涂膜劑基質和空白皮膚勻漿液對川芎嗪的含量測定無干擾，詳見圖1。

2.2.4 精密度試驗取“2.1.5”項下制備的川芎嗪涂膜劑（載藥量50 mg/mL），用生理鹽水稀釋制成低、中、高質量濃度（6.25、25、100 μg/mL）的溶液，于同日內的3個不同時間點，按“2.2.1'，項下色譜條件進樣測定，每個濃度均重復測定6次。結果，川芎嗪峰面積RSD分別為0.49%、0.65%、0.42%（n=6），表明該方法精密度良好。2.2.5重復性試驗取體外經皮滲透試驗中川芎嗪涂膜劑（載藥量50 mg/mL）在90 min時的取樣液各適量，共6份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，并按標準曲線法計算含量。結果，取樣液中川芎嗪含量為24.71 μg/mL，RSD為1.12%（n==6），表明該方法重復性良好。

2.2.6 穩定性試驗精密吸取體外經皮滲透試驗中川芎嗪涂膜劑（載藥量50 mg/mL）在90 min時的接收液適量，分別在室溫下放置0、4、8、12、16、24 h時，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，結果，川芎嗪峰面積RSD為0.61%（n=6）;另取上述樣品接收液適量，于-80℃分別凍融1、2、3、4、5、6次，同法進樣測定，結果，川芎嗪峰面積RSD為1.98%（n=6）。結果表明，樣品接收液在室溫下放置24h或凍融6次的條件下穩定性均較良好。2.2.7加樣回收率試驗精密吸取體外經皮滲透試驗中川芎嗪涂膜劑（載藥量50 mg/mL）在90 min時的接收液（已知含川芎嗪24.71 μg/mL），共5份，每份1 mL，分別加入“2.2.2”項下25 μg/mL的對照品溶液1 mL，混勻，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定并計算加樣回收率。結果，川芎嗪平均加樣回收率為101.6%，RSD為1.91%（n==5），表明本方法準確度較好。

2.3 川芎嗪涂膜劑體外經皮滲透特性考察

2.3.1 離體鼠皮制備參照文獻方法[16]進行離體鼠皮制備。以脫毛膏對大鼠背部皮膚進行脫毛處理，次日將大鼠斷頸處死，分離已脫毛的背部皮膚，仔細剝離皮下脂肪層和結締組織，用生理鹽水沖洗干凈并浸泡，4℃保存備用。

2.3.2 體外經皮滲透試驗取“2.3.1”項下制備的離體鼠皮，置于藥物透皮擴散試驗儀的直立式擴散池（擴散杯面積為2.54 cm2）中，角質層面向供給室，真皮層面向接收室。使皮膚與擴散液（生理鹽水7 mL）結合緊密、無氣泡，設置溫度為（37±0.5）℃、接收池攪拌子轉速為300 r/min[l6]。試驗設置川芎嗪涂膜劑高、中、低劑量組，于離體表皮層皮膚涂抹“2.1.5”項下制備的高、中、低載藥量（100、75、50 mg/mL）的川芎嗪涂膜劑各300 μL，進行經皮滲透試驗，平行測定3次。分別于第15、30、45、60、75、90、120、150、180 min時吸取接收液樣品各1 mL，同時補加等容等溫的新鮮擴散液。取樣液于-80℃冷凍保存，室溫解凍后備測。

2.3.3 數據處理與統計取“2.3.2”項下各時間點的取樣液，根據“2.2”項下方法測定川芎嗪含量，并按照以下公式計算川芎嗪的單位面積累積滲透量（Qn）[17]：Qn=（

）/A0式中，A為有效經皮吸收面積（2.54cm2），V為擴散液總體積（7 mL），K為取樣液體積（1mL），Cn為第n次取樣時樣品接收液中的藥物濃度，Ci為第i次（i≤n-l）取樣時接收液中的藥物濃度。以Qn為縱坐標、時間（t）為橫坐標作經皮滲透曲線圖，并在O～180 min的時間范圍內以Qn對t進行線性回歸，所得斜率即為藥物的滲透速率（J）。

對3種不同載藥量的川芎嗪涂膜劑的經皮滲透曲線進行比較（如圖2所示），結果顯示，高、中、低載藥量的川芎嗪涂膜劑的J值分別為608.42、384.19、158.20μg/（cm2·h）。這表明在載藥量50～100 mg/mL的范圍內，川芎嗪體外滲透速率隨載藥量的增加而增大。

3 討論

在藥物透皮吸收研究中，實驗用離體皮膚的性質及狀態對藥物的經皮滲透行為影響較大。最理想的皮膚材料是利用人體皮膚進行實驗研究，但人體皮膚難以獲得。因此，基于與人體皮膚接近程度及可及性考慮[18-19]，本試驗選擇大鼠皮膚為模型進行制劑的經皮滲透特性研究。

涂膜劑制備工藝的好壞直接影響到涂膜劑的穩定性及其質量。除成膜時間為量化指標外，成膜性、均勻度等性能均是依靠主觀來定性評價，因此本課題組對傳統評分標準進行了改良，將成膜時間、成膜性等分別量化計分，并作為評價涂膜劑的重要指標，設定其權重為0.3;而對于存在一定主觀性的延展性、均勻度、有無氣泡等觀察指標，則將權重設定為0.2，提高了該涂膜劑評價標準的準確性。

本實驗通過單因素考察初步探索了川芎嗪涂膜劑的處方，后續將進一步通過正交設計或響應面法等對制備工藝進行優化。現工藝中涂膜劑的最大載藥量為100 mg/mL。本研究分別考察了高、中、低（100、75、50mg/mL）3種載藥量川芎嗪涂膜劑的體外透皮特性，結果顯示，在透皮擴散面積為2.54 cm2的情況下，75 mg/mL載藥量的涂膜劑滲透速率為384.19 μg/（cm2.h），已達到文獻報道的川芎嗪有效治療血藥濃度的滲透速率范圍即157.17～488.085 μg/（cm2.h）[20]，可作為后續川芎嗪涂膜劑有效載藥量進一步優化篩選的參考依據。

綜上，本研究設計并制備了川芎嗪涂膜劑并初步考察了其體外釋放特性，其制備工藝簡便，所得75 mg/mL載藥量的涂膜劑的體外滲透速率可達到川芎嗪有效血藥濃度的滲透速率范圍。但體外試驗結果無法完全反映體內生物環境的影響，因此后續需進一步評價川芎嗪涂膜劑的體內有效性和安全性，并進行質量研究，以期為該制劑的開發和應用提供更多的理論依據。

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（收稿日期：2019-07-02 修回日期：2019-12-08）

（編輯：段思怡）

△基金項目：國家自然科學基金資助項目（ No.81703742）;云南省科技計劃青年項目（No.2016FD074）;國家地方聯合工程研究中心創新能力建設項目（No.云發改高技[2015]395）;云南省科技創新平臺建設計戈0項目（No.2015DG030）

*碩士研究生。研究方向：藥物新劑型。電話：0872-2214251。E-mail： wy15754632309@126.com

# 通信作者：助理研究員，博士研究生。研究方向：藥物新劑型。電話：0872-22142510 E-mail： 79204431@163.com