二甲雙胍對胰腺癌BxPC-3細胞惡性表型的影響

黃志銓 王振文 朱亮

中圖分類號R965

文獻標志碼A

文章編號1001-0408（2020）02-0202-06

DOI

10.603 9/j .issn.1001-0408.2020.02.14

摘要 目的：探索二甲雙胍對胰腺癌BxPC-3細胞惡性表型的影響。方法：以Smad4基因天然缺失型人胰腺癌BxPC-3細胞為對象，采用CCK-8法和流式細胞術分別檢測不同劑量二甲雙胍（5、10、20 mmol/L）作用24h后的細胞增殖和凋亡情況，并計算細胞存活率和凋亡率;采用Transwell遷移試驗檢測不同劑量二甲雙胍（ 10、20 mmol/L）作用24h后的細胞遷移情況，記錄遷移細胞數;采用實時定量聚合酶鏈反應法和Westem blotting法分別檢測細胞中鈣黏著蛋白E（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、補體反應基因32（RGC-32）的mRNA及蛋白表達情況。結果：與對照組和5mmol/L二甲雙胍組比較，10、20 mmol/L二甲雙胍組細胞的存活率均顯著降低，凋亡率均顯著升高，且20 mmol/L二甲雙胍組細胞的凋亡率顯著高于10 mmol/L二甲雙胍組（P<0.05）。與對照組比較，10、20 mmol/L二甲雙胍組遷移細胞數均顯著減少，且20 mmol/L二甲雙胍組顯著少于10 mmol/L二甲雙胍組（P<0.05）;10、20 mmol/L二甲雙胍組細胞中E-cadherin mRNA及其蛋白的相對表達量均顯著升高，且20 mmol/L二甲雙胍組E-cadherin mRNA的相對表達量顯著高于10 mmol/L二甲雙胍組;10 mmol/L二甲雙胍組細胞中Vimentin mRNA，20 mmol/L二甲雙胍組細胞中Ⅵ一mentin mRNA及其蛋白以及10、20 mmol/L二甲雙胍組細胞中RGC-32 mRNA及其蛋白的相對表達量均顯著降低，且20 mmol/L二甲雙胍組Vimentin mRNA及其蛋白、RGC-32 mRNA的相對表達量均顯著低于10 mmol/L二甲雙胍組（P<0.05或P<0.01）。結論：二甲雙胍可劑量依賴性地通過Smad4非依賴性通路抑制BxPC-3細胞的增殖和遷移，促進其凋亡，這可能與胰腺癌細胞上皮間質轉化過程以及RGC-32表達受到抑制有關。

關鍵詞二 甲雙胍;胰腺癌;BxPC-3細胞;增殖;凋亡;上皮間質轉化;補體反應基因32

胰腺癌是一種早期診斷困難、進展迅速、預后極差的消化系統腫瘤，患者的5年生存率不到10%[1]。近年來流行病學研究顯示，糖尿病是胰腺癌的危險因素之一[2-3]。多項研究表明，二甲雙胍作為治療2型糖尿病的一線治療用藥，可顯著降低糖尿病患者發生胰腺癌的風險，并可顯著延長胰腺癌患者的生存期，但并不能改善晚期或轉移性胰腺癌患者的預后[4-7]。這提示二甲雙胍可能對胰腺癌的早期治療具有重要的臨床意義。

目前學者普遍認為，上皮間質轉化（ Epithelial-mes-enchymal transition.EMT）是胰腺癌由早期發展至進展期的重要病理過程，其發生機制是目前研究的熱點之一[8]。研究顯示，有多條通路參與了胰腺癌的EMT過程，目前研究最多的是轉化生長因子p（TGF-β）通路，該通路可通過其下游Smad依賴性和Smad非依賴性兩種信號通路來誘導腫瘤細胞發生EMT[9]。其中，Smad4基因是Smad依賴性信號通路中的關鍵調節因子，也被認為是一種重要的抑癌因子[10];同時，相關研究指出，超過半數的胰腺癌患者存在Smad4基因缺失或失活，且后者與患者預后不良密切相關[11-12]。鑒于此，本研究擬通過檢測不同劑量二甲雙胍對Smad4基因天然缺失型胰腺癌BxPC-3細胞增殖、凋亡、遷移、EMT等生物學行為的影響，初步探討該藥對胰腺癌細胞上述惡性表型的影響及其基于Smad非依賴性通路的可能作用機制，以期為其抑制胰腺癌分子機制的闡釋以及胰腺癌治療新靶點的挖掘提供參考。

1 材料

1.1 儀器

HeaL Force HF151型C02培養箱、HeaL Force Neo-fuge13R型臺式冷凍離心機（上海力康醫療設備有限公司）;ChemiDoc XRS+型超高靈敏度化學發光成像系統、TlOO型聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）;StepOne型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）;CKX31-A12PHP型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）;NovoCyte 2060R型流式細胞儀（美國ACEA Bio公司）;RT-6100型酶標儀（美國Rayto公司）;DYCP-3IDN型電泳槽（北京六一儀器廠）;TH2-98型溫控搖床（江蘇太倉創造電子有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸二甲雙胍對照品（批號：D9351，純度：≥98.0%，后文簡稱“二甲雙胍”）、胰蛋白酶一乙二胺四乙酸（ EDTA）消化液、胰蛋白酶（不含EDTA）、胎牛血清、結晶紫染色液均購自北京索萊寶科技有限公司;RPMI 1640完全培養液（南京凱基生物科技發展有限公司，批號：KGM31800S-500）;Trizol試劑、Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR混合液、BCA蛋白定量試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司;RIPA細胞裂解液（北京普利萊基因技術有限公司）;超敏發光液（批號：RJ239676）、預染蛋白Marker（批號：26617）均購自美國Thermo Fish-er Scientific公司;CCK-8增殖檢測試劑盒（日本Dojindo公司，批號：CK04）;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司，批號：AP101-100-kit）;小鼠抗人甘油醛一3一磷酸脫氫酶（GAP-DH）單克隆抗體（內參，批號：TA-08）、山羊抗小鼠IgG二抗（批號：ZB-2305）、山羊抗兔IgG二抗（批號：ZB-2301）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司;兔鈣黏著蛋白E（E-cadherin）多克隆抗體（美國Bioss公司，批號：bs-1519R）;兔波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體（英國Abcam公司，批號：ab92547）;兔補體反應基因32（RGC-32）多克隆抗體（美國OmnimAbs公司，批號：OM227971）;聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore公司）;磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，上海帝博思生物科技有限公司）;其余試劑均為市售分析純，水為雙蒸水。

1.3 細胞

人胰腺癌BxPC-3細胞由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。

2 方法

2.1 細胞培養

將BxPC-3細胞接種至含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養液（以下簡稱“完全培養基”）中，置于37℃、5%C02培養箱（下同）中進行常規培養。

2.2 細胞增殖情況考察

采用CCK-8法檢測。取對數生長期BxPC-3細胞，用PBS清洗2次，加入胰蛋白酶-EDTA消化液消化3min，加入RPMI 1640完全培養液（以下簡稱“普通培養基”）適量，混勻，吹打，以1 000 r/min離心5 min;棄去上清液，加入普通培養基重懸，制成密度為IX105個/mL的單細胞懸液，按每孔100 μL（即IX10⁴個/孔）接種至96孔板中，培養;待細胞生長融合至60%時，將其隨機分為對照組和二甲雙胍組（5、10、20 mmol/L，劑量設置參考文獻[13]），每組設5個復孔。棄去培養液，對照組加入普通培養基100 μL，各給藥組加入含相應藥物的普通培養基100 μL，繼續培養24 h;每孔加入CCK-8試劑10 μL，避光培養2h后，使用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，并計算細胞存活率。細胞存活率=（試驗組平均OD值/對照組平均OD值）X100%。上述試驗重復3次（下同）。

2.3 細胞凋亡情況考察

采用流式細胞術檢測。按“2.2”項下方法配制密度為1X10⁴個/mL的單細胞懸液，按每孔2 mL（即2x10⁴個/孔）接種至6孔板中，培養;待細胞生長融合至60%時，將其隨機分為對照組和二甲雙胍組（5、10、20 mmol/L），每組設5個復孔。棄去培養液，對照組加入普通培養基2mL，各給藥組加入含相應藥物的普通培養基2 mL，繼續培養24 h;棄去上清液，用PBS清洗2次，用不含EDTA的胰蛋白酶消化后，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，細胞用PBS清洗2次，以1 000 r/min離心5min，收集細胞（約1.5X105個）。用凋亡檢測試劑盒中的Bindingbuffer試劑500 μL重懸細胞，于暗室中依次加入Annex-in V-FITC染液5μL、PI染液5μL，混勻，室溫避光反應15 min，使用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

2.4 細胞遷移能力考察

采用Transwell遷移試驗考察。按“2.2”項下方法配制密度為2x10⁶個/mL的單細胞懸液，按每孔100 μL（即2x10⁵個/孔）接種至Transwell小室（即“上室”）中，將其隨機分為對照組和二甲雙胍組（10、20 mmol/L，劑量參考“2.2”“2.3”項下結果設置），于各組下室24孔板中加入含相應藥物的普通培養基600 μL，每組設3個復孔，培養24h。取出小室，以PBS清洗后.用棉簽擦拭除去底部內面未穿膜的細胞，用4%多聚甲醛溶液固定30 min后，以0.1%結晶紫染色液染色15 min。用PBS沖洗Transwell小室，并晾干、倒置。使用倒置相差顯微鏡觀察，隨機選取8個高倍視野（x200），記錄每個視野內的遷移細胞數（染成紫色者），取其平均值作為遷移細胞數。

2.5 相關基因mRNA表達情況考察

采用實時定量聚合酶鏈反應法（ qRT-PCR）檢測。按“2.2”項下方法配制密度為IX104個/mL的單細胞懸液，按每孔2 mL（即2x10⁴個/孔）接種于6孔板中，培養，待細胞生長融合至60%時，將其隨機分為對照組和二甲雙胍組（10、20 mmol/L），每組設3個復孔。棄去培養液，對照組加入普通培養基2 mL，各給藥組加入含相應藥物的普通培養基2 mL，繼續培養24 h。采用Trizol試劑提取細胞總RNA，使用HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒將其逆轉錄為cDNA，再以GAPDH為內參，分別對E-cadherin、Vimentin、RGC-32編碼基因進行實時定量PCR擴增。反應體系（共20 μL）：cDNA模板2μL，Ultra-SYBR混合液10 μL，上、下游引物（序列見表1）各0.8 μL，雙蒸水6.4 μL。反應條件：95℃預變性60 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。采用2 -AAC‘法以Excel 2017軟件計算各目標mRNA的相對表達量（Ct表示每個反應管內熒光信號強度達到設定閾值時所經歷的循環數）。

2.6 相關蛋白表達情況考察

采用Western blotting法檢測。按“2.5”項下方法進行細胞接種、分組、給藥，每組設3個復孔。培養24 h后，采用RIPA細胞裂解液裂解細胞，于4℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白于100℃變性后，取50 μg進行聚乙烯酰胺凝膠電泳，電泳后濕法轉移至PVDF膜上，以5%胎牛血清于4℃封閉過夜;加入相應一抗（GAPDH、E-cadherin、Vimen-tin、RGC-32的稀釋度分別為1：2 000、1：500、1：2 000、1：1 500），于室溫搖床中孵育3h;用TBST緩沖液清洗10 minx3次，加入二抗（GAPDH加入山羊抗小鼠IgG二抗，其余蛋白加入山羊抗兔IgG二抗，稀釋度均為1：2 000），于室溫搖床中孵育2h;用TBST緩沖液清洗10 minx3次，以超敏發光液顯色后，置于超高靈敏度化學發光成像系統中成像。采用Image J l.8軟件分析，以目標蛋白與內參GAPDH的灰度值比值來表示該蛋白的相對表達量。

2.7 統計學方法

采用SPSS 19.O軟件對數據進行統計分析。采用Kolmogorov-Smimov檢驗進行正態分布分析，符合正態分布的計量資料以x±s表示，采用t檢驗;不符合正態分布的計量資料以中位數±四分位數間距表示，采用Wil-coxon秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 二甲雙胍對BxPC-3細胞增殖的影響

與對照組比較，10、20 mmol/L二甲雙胍組細胞存活率均顯著降低，且顯著低于5 mmol/L二甲雙胍組（P<0.05）;而5 mmol/L二甲雙胍組細胞存活率與對照組比較，10、20 mmol/L二甲雙胍組細胞存活率組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表2。

3.2 二甲雙胍對BxPC-3細胞凋亡的影響

與對照組比較，10、20 mmol/L二甲雙胍組細胞凋亡率均顯著升高，且10、20 mmol/L二甲雙胍組顯著高于5mmol/L二甲雙胍組，20 mmol/L二甲雙胍組顯著高于10 mmol/L二甲雙胍組（P<0.05）;而5 mmol/L二甲雙胍組細胞凋亡率與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05），詳見圖1、表2。

3.3 二甲雙胍對BxPC-3細胞遷移能力的影響

與對照組比較，10、20 mmol/L二甲雙胍組遷移細胞數均顯著減少，且20 mmol/L二甲雙胍組顯著少于10mmol/L二甲雙胍組（P<0.05），詳見圖2（圖中，“箭頭”所示為遷移細胞）、表3。

3.4 二甲雙胍對BxPC-3細胞中E-cadherin、Vimentin、RGC-32 mRNA表達的影響

與對照組比較，10、20 mmol/L二甲雙胍組細胞中E-cadherin mRNA的相對表達量均顯著升高，且20mmol/L二甲雙胍組顯著高于10 mmol/L二甲雙胍組;Vimentin、RGC-32 mRNA的相對表達量均顯著降低，且20 mmol/L二甲雙胍組均顯著低于10 mmol/L二甲雙胍組（P<0.05），詳見表3。

3.5 二甲雙胍對BxPC-3細胞中E-cadherin、Vimentin、RGC-32蛋白表達的影響

與對照組比較，10、20 mmol/L二甲雙胍組細胞中E-cadherin蛋白的相對表達量均顯著升高;20 mmol/L二甲雙胍組細胞中Vimentin蛋白以及10、20 mmol/L二甲雙胍組細胞中RGC-32蛋白的相對表達量均顯著降低，且20 mmol/L二甲雙胍組Vimentin蛋白的相對表達量顯著低于10 mmol/L二甲雙胍組（P<0.05）;而各給藥組其余指標組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05），詳見圖3、表4。

4 討論

由于胰腺癌常用的化療藥（如吉西他濱等）療效不佳、不良反應多，故尋找安全有效的抗腫瘤新藥尤為重要[14]。有研究表明，糖尿病與胰腺癌密切相關：一方面，長期罹患糖尿病的患者發生胰腺癌的風險增高;另一方面，隨著胰腺癌的進展，患者糖尿病的發生率也會升高[3]。二甲雙胍是目前是降糖藥物抗腫瘤作用研究的熱點之一，但其抗腫瘤機制尚未闡明[15]。本研究結果顯示，與對照組比較，5 mmol/L二甲雙胍組BxPC-3細胞的增殖率和凋亡率均無明顯變化，而10、20 mmol/L二甲雙胍組細胞存活率則顯著降低、凋亡率顯著上升，且20mmol/L二甲雙胍組細胞的凋亡率顯著高于10 mmol/L二甲雙胍組。這提示，10、20 mmol/L的二甲雙胍可明顯抑制胰腺癌BxPC-3細胞的增殖并促進其凋亡，與NairV等[16]在Pancl、Panc28、L3.6pL等胰腺癌細胞株中的研究結果類似，但后者并未采用Smad4基因天然缺失型的BxPC-3細胞，本研究可作為上述研究的補充。

有研究顯示，二甲雙胍可能是通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）來抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/磷脂酰肌醇3一激酶/蛋白激酶B （mTOR/PI3K/Akt）信號通路，進而抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡和自噬[17-18]。Incio J等㈣研究顯示，二甲雙胍可通過改善胰腺癌患者促炎微環境來延緩其疾病進展，而這一過程可能與EMT受到抑制有關。EMT是指在某些生理和病理狀態下出現的上皮細胞向間質細胞轉化的現象，主要表現為細胞極性喪失、黏性下降或消失、運動和侵襲能力增強;同時，細胞表型也發生了改變，E-cadherin等上皮表型標記分子表達逐漸減少，而Vimentin等間皮表型標記分子表達則逐漸升高[20]。本研究結果顯示，10、20 mmol/L二甲雙胍組細胞遷移數均較對照組顯著減少，且20 mmol/L二甲雙胍組顯著少于10 mmol/L二甲雙胍組。這提示，二甲雙胍可抑制胰腺癌BxPC-3細胞的侵襲和轉移，且呈劑量依賴性。此外，本研究結果還顯示，10、20 mmol/L二甲雙胍組細胞中E-cadherin蛋白及其mRNA表達水平均較對照組顯著升高，且20 mmol/L二甲雙胍組E-cad-herin mRNA表達水平顯著高于10 mmol/L二甲雙胍組;10 mmol/L二甲雙胍組細胞Vimentin mRNA以及20mmol/L二甲雙胍組細胞Vimentin蛋白及其mRNA表達水平均較對照組顯著降低，且20 mmol/L二甲雙胍組Vi-mentin蛋白及其mRNA表達水平均顯著低于10 mmol/L二甲雙胍組。這提示，二甲雙胍可能通過抑制EMT來扼制胰腺癌細胞的侵襲和轉移，且這種作用具有劑量依賴性，但具體機制尚有待后續研究予以完善。此外，由于BxPC-3細胞為Smad4基因天然缺失型胰腺癌細胞株，結合上述結果可知，二甲雙胍對胰腺癌細胞EMT的抑制作用可能是通過Smad非依賴性通路完成的，提示該非依賴性通路可能對于胰腺癌的發生發展更為重要，值得進一步研究。

RGC-32作為誘導補體激活的反應因子，在包括胰腺在內的多種正常組織中均有表達，具有調控細胞周期、促進細胞分化、調節免疫等生物學功能[21]。本課題組在前期研究中首次對RGC-32在胰腺癌進展中的作用進行了深入探討。結果顯示，RGC-32是胰腺癌的促癌因子，在胰腺癌組織中呈高表達，且可通過介導胰腺癌的EMT過程而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移;同時，這一作用并不依賴于Smad4基因，相反可通過Smad非依賴性通路實現[22-25]，但RGC-32在二甲雙胍治療胰腺癌中的作用如何尚未見相關報道。有研究表明，RGC-32與脂質代謝和胰島素抵抗有關，該因子可介導高脂飲食誘導的肥胖，并在胰島素抵抗機制中發揮重要作用[26];同時，RGC-32可通過促進脂肪從頭合成，從而誘導脂肪肝的形成[27]。考慮到二甲雙胍是通過改善胰島素抵抗、調控脂質代謝來發揮降糖作用，故本課題組推測RGC-32很可能是二甲雙胍的下游作用靶點之一。本研究結果顯示，10、20 mmol/L二甲雙胍組細胞中RGC-32蛋白及其mRNA的表達水平均較對照組顯著降低，且20 mmol/L二甲雙胍組RGC-32 mRNA的表達水平顯著低于10mmol/L二甲雙胍組。這提示，二甲雙胍可下調RGC-32的表達，該因子可能是二甲雙胍發揮抑癌作用的靶點之一，但具體作用及相關信號通路機制有待進一步研究。

綜上所述，二甲雙胍可通過Smad非依賴性通路抑制BxPC-3細胞增殖和遷移，促進其凋亡，這可能與胰腺癌細胞EMT過程以及RGC-32表達受到抑制有關。但本研究尚存在不足之處，例如未設置陽性對照組與抗腫瘤藥物進行比較等，故仍有待后續研究進一步完善。

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（收稿日期 ： 2019-05-14 修回日期 ： 2019-10-19）

△基金項目：江西省青年科學基金資助項目（No.20171BAB215044）;江西省教育廳科學技術研究項目（No.170006）;江西省衛生計生委科技計劃項目（No.20195082）

*碩士研究生。研究方向：胰腺癌的侵襲和轉移機制。電話：0791-88694228.

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#通信作者：副主任醫師，碩士生導師，博士。研究方向：胰腺癌的侵襲和轉移機制。電話：0791-88694228。E-mail： 89493075@qq.com